SPTBN1对结直肠腺癌细胞及其多倍体肿瘤巨细胞生物学行为的影响及分子机制

陈 静，曹立宇，白真真，温奕巽，王 玥

结直肠腺癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和病死率分别位居恶性肿瘤的第3位和第2位[1]。目前，结直肠腺癌的治疗首选手术切除并辅以化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等，部分患者行规范化治疗后仍会复发或转移[2]。近年研究发现结直肠腺癌的复发与转移可能与多倍体肿瘤巨细胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)的形成有关[3]。PGCCs是指细胞核大小至少是常规癌细胞的3倍或至少有3个核的细胞[4]。应用结直肠腺癌一线化疗药奥沙利铂诱导PGCCs并研究其分子机制有望突破结直肠腺癌的临床治疗难题。βⅡ-血影蛋白1(spectrin beta chain, non-erythrocytic 1, SPTBN1)是一种重要的细胞骨架蛋白，研究发现SPTBN1与多种癌症相关，并且SPRBN1的表达和功能在不同肿瘤阶段或类型之间存在差异[5]。SPTBN1在肝细胞癌、肺癌和胰腺癌中的表达下降，SPTBN1表达降低可促进肿瘤的发生、发展[6-8]。然而，SPTBN1是否调控结直肠腺癌的恶性进展，目前尚未见相关文献报道。本实验着重探讨SPTBN1对结直肠腺癌细胞及其PGCCs生物学行为的影响，期望为临床治疗结直肠腺癌提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年12月～2022年3月安徽医科大学附属阜阳医院存档的结直肠腺癌组织及配对癌旁正常组织样本(距癌组织>2 cm)10例，样本均经病理检查确诊。其中男性6例，女性4例。患者术前均未接受放疗、化疗及其他治疗。

1.2 数据库信息应用UALCAN、GEPIA、TCGA portal和CPTAC数据库分析SPTBN1在泛癌和结直肠腺癌中mRNA及蛋白的表达；应用Kaplan-Meier Plotter、PrognoScan和UALCAN数据库探索SPTBN1与结直肠腺癌患者预后的关系。

1.3 试剂SPTBN1(DF8341)、PTPRN2(AF9171)、E-cadherin(AF0131)及β-actin抗体，均购自Affinity公司。Western blot试剂盒购自武汉碧云天生物公司。PTPRN2-siRNA序列及SPTBN1-siRNA序列由上海吉玛生物公司合成。奥沙利铂由MedChemExpress公司提供。

1.4 细胞培养及PGCCs的诱导HCT116和LOVO细胞均购自American Tissue Culture Collection公司。HCT116和LOVO细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的1640培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞密度约70%时，分别在HCT116和LOVO细胞中加入10 μmol/L和25 μmol/L奥沙利铂继续培养48 h，每天更换培养基直至出现含多核或巨大胞核的细胞即为PGCCs，即为处理组细胞HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs。

1.5 Western blot法收集结直肠腺癌组织标本、结直肠腺癌细胞及PGCCs，加入RIPA裂解液提取总蛋白，用6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。加入一抗SPTBN1(稀释比1 ∶2 000)、PTPRN2(稀释比1 ∶2 000)和β-actin(稀释比1 ∶10 000)4 ℃冰箱过夜，再加入HRP标记的兔二抗(稀释比1 ∶10 000)室温孵育2 h，利用凝胶成像仪曝光并记录。

1.6 平板克隆实验细胞达70%～80%融合度时，消化获得单细胞悬液，计数并将细胞稀释成每毫升30、60、120个细胞加入到12孔板中，培养1～2周直至出现肉眼可见的细胞团。用无水甲醇固定30 min，加入0.1%结晶紫室温染色30 min，显微镜下计数。

1.7 划痕实验细胞消化后平铺于6孔板上，待细胞均匀、单层铺满整个孔后，用无菌枪头垂直均匀的划出划痕，分别在0、12、24 h于同一位置拍照，用Image J软件测量两组细胞的划痕面积。划痕指数=(0 h的划痕面积-指定时间点的划痕面积)/0 h的划痕面积。

1.8 细胞转染实验选处于对数生长期的细胞，待细胞密度达50%～60%开始转染。具体操作流程参考试剂盒说明书。转染48 h检测细胞蛋白表达状况。PTPRN2-siRNA序列：5′-GAACGAUGGAGUG UUUGGATTUCCAAACACUCCAUCGUUCTT-3′；SPTBN1-siRNA序列：5′-ACCUUCGAGAUGGACGGAUGC UCAU-3′。

2 结果

2.1 SPTBN1在泛癌和结直肠腺癌组织中的表达CPTAC数据库分析显示，在包含结直肠腺癌在内的大部分癌症中SPTBN1的蛋白表达水平明显低于癌旁正常组织(图1A、B)。进一步分析SPTBN1蛋白表达与结直肠腺癌临床病理特征的相关性发现，其与结直肠腺癌临床分期密切相关。与癌旁正常组织相比，SPTBN1蛋白在不同分期结直肠腺癌组织中的表达均显著降低，且随着临床分期的增高SPTBN1蛋白表达呈下降趋势(图1C)。

图1 CPTAC数据库分析SPTBN1蛋白在泛癌及结直肠腺癌中的表达：A.SPTBN1蛋白在泛癌和癌旁正常组织中的表达(蓝色柱表示正常组织，红色柱表示癌组织)；B.SPTBN1蛋白在结直肠腺癌及癌旁正常组织中的表达；C.结直肠腺癌临床分期与SPTBN1蛋白表达的关系；*P<0.05，***P<0.001

2.2 SPTBN1表达与结直肠腺癌患者预后的关系PrognoScan数据库分析显示，在GSE17537和GSE17536数据集中SPTBN1低表达患者的总生存率(图2A)、无瘤生存率(图2B)和疾病特异生存率(图2C)明显短于高表达患者。此外，Kaplan-Meierplotter(图2D)、UALCAN(图2E)和Oncolnc(图2F)数据库进一步证实了SPTBN1高表达患者的总生存率明显高于低表达患者。结果提示，SPTBN1低表达与结直肠腺癌患者的不良预后呈正相关。

图2 SPTBN1表达与结直肠腺癌患者的预后关系：PrognoScan数据库分析SPTBN1表达与结直肠腺癌患者总生存率(A)、无瘤生存率(B)和疾病特异生存率(C)的关系；Kaplan-Meierplotter数据库(D)、UALCAN数据库(E)、Oncolnc数据库(F)分析SPTBN1表达与结直肠腺癌患者总生存率的关系

2.3 PGCCs中SPTBN1的表达水平及其增殖、迁移能力的变化Western blot检测结果显示，SPTBN1蛋白在结直肠腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织(图3A)。此外，Western blot实验分析结果显示SPTBN1在HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞中的表达量均明显低于HCT116及LOVO细胞(图3B)。平板克隆实验表明：与HCT116及LOVO细胞相比，HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞的增殖能力更强(图3C)；划痕实验发现：HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞具有更强的迁移能力(图3D)。

图3 SPTBN1在结直肠腺癌中的表达及PGCCs的功能实验：A.Western blot法检测SPTBN1蛋白在结直肠腺癌组织和癌旁正常组织中的表达；B.Western blot法检测SPTBN1在对照组HCT116和LOVO细胞和处理组HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中的表达；C.平板克隆实验比较奥沙利铂处理前后细胞的增殖能力；D.划痕实验显示经奥沙利铂处理前后细胞的迁移能力

2.4 敲低SPTBN1对结直肠腺癌PGCCs细胞增殖和迁移的影响应用siRNA敲低结直肠腺癌细胞中SPTBN1的表达水平后进行功能实验。平板克隆实验表明，应用siRNA敲低SPTBN1表达后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞克隆数明显高于阴性对照组(图4A)。划痕实验结果显示，SPTBN1敲低组HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞划痕愈合度明显高于阴性对照组(图4B)。

图4 敲低SPTBN1对HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞增殖和迁移的影响：A.平板克隆实验检测敲低SPTBN1后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs的增殖能力；B.划痕愈合实验比较敲低SPTBN1后HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs的迁移能力

2.5 PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin轴的调控机制GEPIA数据库分析发现，在结直肠腺癌中SPTBN1表达与E-cadherin、PTPRN2表达呈显著正相关(图5A、B)。Western blot法检测结果显示，与阴性对照组相比，SPTBN1敲低组HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中E-cadherin蛋白表达水平明显下降(图5C)；PTPRN2敲低组HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs中SPTBN1、E-cadherin蛋白表达水平明显低于阴性对照组(图5D)。

图5 SPTBN1可能的调控机制：A、B.GEPIA数据库分析在结直肠腺癌中SPTBN1与E-cadherin、PTPRN2之间的关系；C.Western blot法检测在结直肠腺癌PGCCs中敲低SPTBN1前、后E-cadherin的表达变化；D.Western blot法检测在结直肠腺癌PGCCs中敲低PTPRN2前、后SPTBN1和E-cadherin的表达变化

3 讨论

近年，结直肠腺癌的发病率和病死率逐年增加。随着治疗方法的改进，结直肠腺癌的总体生存率有所提高，但化疗后的复发和转移仍是患者主要的死亡原因[9]。研究发现，奥沙利铂诱导的PGCCs的增殖和迁移能力强于未处理的癌细胞[10]。因此，探究化疗药诱导PGCCs的具体作用及分子机制对结直肠腺癌的治疗具有指导意义。

SPTBN1是血影蛋白家族中最常见的非红细胞亚型[11]，在胚胎发育、神经系统疾病、心血管疾病、骨质疏松症和听力丧失中发挥重要作用[12-14]。

SPTBN1通过参与Notch、NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路来介导肿瘤的发生、发展[5,8]。在乳腺癌和卵巢癌中SPTBN1低表达通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促进肿瘤的迁移[15-17]。本实验中，CPTAC数据库和Western blot法检测结果均显示，SPTBN1蛋白在结直肠腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织。生物信息数据分析显示，SPTBN1低表达与结直肠腺癌患者的不良预后呈正相关。本实验利用奥沙利铂诱导的HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞的增殖和迁移能力高于未处理的HCT116和LOVO细胞，而且SPTBN1蛋白在PGCCs中的表达量明显低于HCT116和LOVO细胞。因此，作者推测SPTBN1可能在抑制结直肠腺癌的恶性生物学行为中发挥重要作用。

PTPRN2属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，参与胰岛素和神经内分泌递质的胞吞过程[18-19]。文献报道，miR-425通过下调PTPRN2促进肝癌的增殖、迁移和侵袭[20-21]。E-cadherin是EMT中重要的上皮标志物蛋白，其表达下降是肿瘤发生转移、侵袭的前提条件[22]。本实验中，GSEA数据库分析发现SPTBN1蛋白表达与E-cadherin、PTPRN2蛋白表达呈正相关。敲低HCT116-PGCCs及LOVO-PGCCs细胞中的SPTBN1后，E-cadherin蛋白表达下降；在上述细胞中敲低PTPRN2后，SPTBN1蛋白和E-cadherin蛋白的表达水平明显降低。结果提示，PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路可能共同参与抑制结直肠腺癌的增殖和迁移。

综上所述，本实验验证SPTBN1在结直肠腺癌中发挥抑癌作用，提示SPTBN1可能是结直肠腺癌的潜在治疗靶点。但本实验对于PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路在调控结直肠腺癌增殖与迁移能力方面的研究尚存在不足，SPTBN1在结直肠腺癌中的分子机制尚未完全验证。本课题组将进一步对PTPRN2/SPTBN1/E-cadherin通路进行深入探究，为治疗结直肠腺癌提供新的分子靶点。