惠州地区血红蛋白E 病患者的基因型与血液学特征分析

官凌燕 吴志勇 邱佩绵

血红蛋白病是具有遗传性的溶血性疾病，也是人类最常见的孟德尔遗传病之一，分为异常血红蛋白（Hemoglobin，Hb）和地中海贫血（简称地贫）两大类。异常Hb 和地贫均是由于珠蛋白基因发生缺陷，前者导致珠蛋白肽链分子结构异常，而后者导致珠蛋白肽链合成不足或者不能够合成［1］。血红蛋白E 病是一种β-地中海贫血样的血红蛋白病，它的表型可从无症状到严重症状，属于β+-地贫［2］。血红蛋白E 病存在明显的地域性差异，在东南亚和我国南方地区最常见［3-4］。国内对血红蛋白E 病系统、详细的大规模血液学特征与基因型的研究资料极少［5］，现阶段也未见关于惠州地区血红蛋白E 病血液学特征的详细报道。本研究通过大数据分析惠州地区血红蛋白E 病患者的基因型与血液学特征，为疾病筛查和产前诊断以及遗传咨询提供临床参考资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014 年4 月至2021 年10 月在惠州市中心人民医院和惠州市第一妇幼保健院进行地贫基因检测的标本共114 902 例。纳入标准：选择经检测确诊为Hb E 病的546 例患者作为研究对象。其中男246 例，平均年龄（28.96±8.52）岁；女300 例，平均年龄（26.72±6.57）岁。排除标准：排除年龄＜2 岁的患者。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，所有受试者或其家属均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

日本希森美康公司XE-5000 血细胞分析仪，法国Sebia 公司Capillarys 2 型全自动毛细管电泳仪，广州达安基因股份有限公司Smart32 型核酸提取仪，美国BIO-RAD 公司S1000 PCR 扩增仪，美国Luminex 公司Magpix 多功能液态悬浮芯片检测系统，广州凯普医药科技有限公司HB-2012A 医用核酸分子杂交仪。血常规及电泳试剂均为仪器配套；全基因组DNA 提取试剂盒、地中海贫血（α/β型）基因检测试剂盒均购于广州达安基因股份有限公司；α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒购于广州凯普医药科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

采集待检者的静脉血两管（2 mL/管），一管以EDTA-K2抗凝，用于血常规分析和地贫基因分析；一管以ACD 抗凝，用于血红蛋白电泳分析。

1.3.2 血液学分析

使用XE-5000 血细胞分析仪检测红细胞参数，主要观察指标为血红蛋白（hemoglobin，Hb）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）和平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）；使用Capillarys 2 型全自动毛细管电泳仪分析血红蛋白组分及含量，主要观察指标为血红蛋白A2（hemoglobin A2，Hb A2）、血红蛋白F（hemoglobin F，Hb F）和异常血红蛋白E（hemoglobin E，Hb E）。

1.3.3 DNA 提取

使用Smart32 型核酸提取仪配套使用全基因组DNA 提取试剂盒提取全血DNA。

1.3.4 地贫基因分析

获取的全血DNA 使用地中海贫血（α/β 型）基因检测试剂盒与α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒，分别采用PCR-流式荧光杂交技术与导流杂交技术进行地贫基因分析，检测中国人常见的3 种缺失型α 地贫（--SEA、-α3.7、-α4.2）和3 种非缺失型α 地贫（αCSα、αQSα、αWSα）以及17 种β 地贫［CD14-15、CD17、CD26（βE）、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、-28、-29、-30、-32、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、Initiation codon、Cap+40-43］，具体实验步骤严格按照试剂说明书和仪器操作使用说明书进行操作。

1.3.5 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析；计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析；计数资料采用n或（%）表示；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 惠州客家地区Hb E 病的发生率及基因型分布

在114 902 例外周血地贫基因检测样本中，共检测出Hb E 546 例，人群发生率为0.475%（546/114 902）。研究中共检出15 种基因型，其中以Hb E 杂合子分布居多，占84.80%，Hb E 合并SEA 杂合子次之，占7.88%。见表1。

表1 惠州客家地区Hb E 病的发生率及基因型分布Table 1 The incidence and genotype distribution of Hb E disease in Huizhou Hakka area

2.2 血液学特征

2.2.1 轻型Hb E 病患者的血液学参数

按基因突变类型分为3 组，分别为αα/αα，βE/ βN组、α+/αα，βE/ βN组和α0/αα，βE/ βN组。其535 例轻型Hb E 病患者均表现为小细胞低色素性贫血，Hb E 含量随着合并α-珠蛋白基因突变个数的增多而减少。见表2。

表2 535 例轻型Hb E 病患者的血液学参数（±s）Table 2 The hematological parameters of 535 patients with mild Hb E disease（±s）

表2 535 例轻型Hb E 病患者的血液学参数（±s）Table 2 The hematological parameters of 535 patients with mild Hb E disease（±s）

注：α+/αα：1 个α-珠蛋白基因发生突变；α0/αα：2 个α-珠蛋白基因发生突变。

基因型αα/αα，βE/βN α+/αα，βE/βN α0/αα，βE/βN n 463 28 44 Hb（g/L）129.53±17.82 127.09±20.56 123.46±19.91 MCV（fL）76.91±4.42 79.84±5.73 69.52±5.93 MCH（pg）25.37±1.68 26.15±2.23 22.05±2.11 Hb A2（%）3.42±0.39 3.63±0.42 3.66±0.42 Hb E（%）24.17±2.85 22.42±2.28 16.18±2.03

2.2.2 中重型Hb E 病患者的血液学特征

Hb E 合并Hb H 病，均表现为轻度贫血，未检出异常Hb H，Hb A2含量小于3.5%，Hb E 含量在10%左右。Hb E 复合β-28表现为轻至中度贫血，Hb A2含量均大于5%，Hb E 含量在50%左右，而Hb E 复合β-28合并α-地贫时表现为轻度贫血。Hb E 复合βCD41-42与Hb E 复合βIVS-Ⅱ-654均表现为重型β-地贫，Hb F 明显升高，含量大于50%。11例中重型Hb E 病患者的血液学分析结果见表3。

表3 11 例中重型Hb E 病患者的血液学特征Table 3 The hematological characteristics of 11 patients with intermediate or major Hb E disease

2.3 三组Hb E 病患者之间的血液学参数比较

采用单因素方差分析对表2 中的3 组基因型患者的血液学参数进行两两比较，具各组间的Hb 差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。其余各血液学参数比较的箱线图见图1。各组间的MCV 与Hb E 差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，各组Hb E 含量的原始数据分布最集中。

表4 3 组Hb E 病患者之间的血液学参数比较分析Table 4 Comparison and analysis of hematological parameters in three groups of Hb E patients

图1 3 组Hb E 病患者之间的血液学参数比较分析Figure 1 Comparison and analysis of hematological parameters in three groups of Hb E patients

3 讨论

血红蛋白E 病是一种β-地中海贫血样的血红蛋白病，它的致病机制是β-珠蛋白基因的第26位密码子发生基因突变，致使谷氨酸（Glutamic acid，Glu）变成赖氨酸（Lysine，Lys），由于碱基替代，β-珠蛋白基因mRNA 的前体在加工过程出现了异常，从而导致β-珠蛋白肽链合成不足且血红蛋白结构发生异常［6］。有研究报道，虽然我国的异常Hb 多对人体无影响，但若Hb E 合并β-地贫可表现为中重度贫血，再合并α-地贫时可减轻相应症状［7］。

本研究对惠州客家地区血红蛋白E 病患者的基因型与血液学特征进行了分析，在114 902 例受检患者样本中，共检出546 例Hb E 病患者，人群发生率为0.475%，高于广东信宜地区（0.398%）［8］和深圳地区（0.105%）［9］，低于云南地区（1.1%）［10］。Hb E 杂合子患者表现为轻微小细胞低色素性贫血，合并α+-地贫时表型有所缓解，αα/αα，βE/βN组与α+/αα，βE/βN组比较，MCV 差异有统计学意义，而Hb 与MCH 差异无统计学意义，这是由于突变的α-与β-珠蛋白基因导致α-链与β-链合成量均减少，得以重新保持相对平衡造成的；而合并α0-地贫时表现为明显的小细胞低色素性贫血，符合典型α0-地贫的红细胞特征，αα/αα，βE/βN组与α0/αα，βE/βN组比较，MCV 与MCH 差异均有统计学意义，这可能是由于α0-地贫导致α-链合成量过少，而β-链相对过剩致使α/β-链失衡造成的。以上研究结果表明Hb E 杂合子患者合并α+-地贫时表型有所缓解，而合并α0-地贫时表型不能被缓解。综上，Hb E 杂合子患者的红细胞特征表现为介于α+-地贫与α0-地贫的特征，如同αQSα，具有低MCV与低MCH 的特征［11］，行血红蛋白电泳检测可以进一步鉴别。研究表明［12］，在筛查血红蛋白E 病上，毛细管电泳法要优于高效液相色谱法，不仅能将Hb E 与Hb A2条带分离，还能对其准确定量。此外，本研究表明，第一，Hb E 杂合子无论是否合并α+-地贫或α0-地贫，其Hb A2含量均在3.5%这个临界值左右（参考范围2.5%≤Hb A2≤3.5%），与苏恒学等［13］的研究一致。第二，异常Hb E 含量随着合并α-珠蛋白基因突变个数的增多而减少，且结合图1 可看出各组Hb E 含量的原始数据分布较为集中，这是由于突变的α-珠蛋白基因导致α-链合成量减少，造成变异的β-链与α-链合成减少，即Hb E合成减少。

在本研究的11 例中重型Hb E 病患者中，有2例Hb E 病合并Hb H 病，均表现为轻度贫血，未检出异常Hb H，但MCV 和MCH 极低，说明Hb E 病合并Hb H 病可能是由于3 个α-珠蛋白基因突变导致α-链合成严重不足，而Hb E 病导致β-链合成也减少，同时生成异常Hb E，既缓解了α/β-链的严重失衡，在低水平保持相对平衡，又无过多的β-链得以合成β 四聚体，即异常Hb H，与官志扬等［14］的研究结果相似。据文献报道［15］，这种复合型也称为AE Bart's 病。

值得注意的是，Hb E 复合β-28本是中间型β-地贫，患有该基因型的患儿在特定的情况下需偶尔输血［16］，而当Hb E 复合β-28合并α-地贫时表现为轻度贫血，表明α-地贫可以缓解中间型β-地贫，若诊断出孕妇所怀胎儿的地贫基因为该基因型，则可以建议该孕妇继续妊娠。据文献报道［17-18］，Hb E 复合βCD41-42以及Hb E 复合βIVS-Ⅱ-654的患者临床表型个体差异大，既可表现为中间型，也可表现为重型，而本研究的这两例患者均表现为重型β-地贫，依赖输血，Hb F 含量明显升高，大于50%，无Hb A 和Hb A2合成。

综上，广东省惠州市位于我国南方地区并且聚集客家人，有高携带风险，且人群携带率高达16.82%［19］。而惠州地区Hb E 病发生率较高，本研究分析比较了血红蛋白E 病患者基因型与表型的相关性，不仅能为疾病筛查提供参考数据以及指导临床医生为患者提供遗传咨询和产前诊断，还能完善惠州地区的地贫防控工作。