p53/CytC/Apaf-1介导线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中的作用

张彐宁 靳晓飞 高维娟

(河北中医学院 河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

脑卒中的发病类型主要包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中的发病率高于出血性脑卒中，占脑卒中总数的70%～80%〔1〕。缺血性脑卒中的发病机制较为复杂，主要与能量代谢障碍、活性氧增多、钙超载、炎性反应、细胞凋亡、自噬、高能磷酸化合物生成障碍、兴奋性氨基酸毒性作用等多种内外因素相关〔2〕。各因素之间互相作用，最终导致了神经功能破坏、脑梗死灶的形成。研究发现，线粒体功能异常是缺血性脑卒中病理进程中的关键一环。线粒体功能异常，可引起促凋亡相关因子表达增强，激活线粒体凋亡通路，引起缺血性脑卒中神经功能障碍〔3〕。本文就p53/细胞色素(Cyt)C/凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)-1介导的线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中的作用进行综述。

1 线粒体凋亡通路与缺血性脑卒中

1.1细胞凋亡的概念 1842年，德国科学家Carl Vogt首先对凋亡进行了描述。1885年，解剖学家Walther Flemming做出了程序性细胞死亡的精准描述。直到1965年，细胞凋亡才被学术界重新重视，当时利用电镜技术，明确地区分凋亡细胞与创伤性死亡的细胞。1972年病理学家Kerr等将自然细胞死亡过程定义为凋亡。凋亡是指在体内外因素的诱导下，由严格和复杂的信号网络调控而发生的自主性细胞有序死亡过程〔4〕，细胞凋亡主要表现为细胞缩小、细胞质膜泡状化、核固缩、DNA裂解为片段，最后胞膜下陷分割包裹胞质及细胞器，最终形成凋亡小体，被周围的巨噬细胞所吞噬，从而维持生物体的正常代谢过程和内环境的稳定。

1.2线粒体凋亡通路的发生过程 线粒体凋亡通路是一种典型的caspase依赖性的程序性细胞死亡方式，线粒体作为一个储存器，它储存了较多的促凋亡蛋白如CytC、凋亡诱导因子(AIF)、核酸内切酶G及caspases-2，3，8，9酶原等〔5〕，当细胞受到内部凋亡诱导因素及p53等外部凋亡诱导因素刺激时，引起线粒体自身应激反应，导致线粒体膜通透转换孔(PTP)开放，CytC等促凋亡蛋白由线粒体膜间隙释放入胞质，在dATP存在的情况下立即与Apaf-1结合，使Apaf-1暴露自身的caspase募集结构域(CARD)，同时与Procaspase-9的CARD结构域结合形成凋亡酶体复合物，即凋亡小体，进而激活caspase-9，引起caspase连锁反应，导致caspase-3，caspase-6，caspase-7等下游凋亡蛋白逐一被激活，成为细胞凋亡的执行者，进而激活和裂解核酸内切酶、核纤层蛋白酶等的作用底物，最终降解细胞骨架，致细胞凋亡〔6〕。

1.3线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中的作用 线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所，以ATP形式为机体提供大部分能量，是整个机体的发电厂〔7〕。脑是对缺血缺氧最敏感、耐受能力最差的器官，由于兴奋性神经递质的传递，大脑具有高能量需求，而大脑的能量储备低，主要依赖于葡萄糖的有氧氧化，高ATP转换又使大脑易受缺血性损伤的影响〔8〕。当缺血性脑卒中发生时，线粒体受损，能量合成障碍，脑组织ATP迅速减少，位于细胞膜的离子泵功能障碍，导致细胞水肿，线粒体肿胀，使受损线粒体释放出许多的促凋亡物质，从而激活线粒体凋亡通路，引起caspase级联反应，最终降解细胞内蛋白质，导致细胞的死亡。

Li等〔9〕从出生1～2 d的SD大鼠幼仔中分离提取原代神经元，建立氧糖剥夺(OGD)模型，模拟了缺血性脑卒中神经元损伤环境，在细胞水平，观察了线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中神经元凋亡的影响。结果发现，模型组神经元活性显著降低，CytC与caspase-3蛋白表达明显升高，TUNEL染色阳性细胞数量显著增多，神经元出现明显的凋亡现象，表明在缺血性脑卒中的病理进程中激活了线粒体凋亡通路。Bao等〔10〕采用OGD诱导的RGC-5细胞损伤模型，模拟缺血性脑卒中损伤环境，应用CCK-8，流式细胞术和Western印迹对OGD诱导的RGC-5细胞损伤进行研究。结果发现，模型组线粒体凋亡通路相关因子p53，Bax，cleaved-caspase-3/-9表达均显著增高。表明线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中发病过程中发挥了重要作用。Xie等〔11〕通过建立SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型，采用在体实验模拟缺血性脑卒中神经元损伤环境，观察了p53介导的Bax/CytC/caspase-3线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中大鼠中的作用。研究发现，模型组大鼠脑梗死体积较大并伴有严重脑水肿，Nissl、TUNEL染色阳性细胞数量增多，线粒体凋亡通路相关蛋白Bax、CytC、caspase-3表达显著增高。以上研究都表明了缺血性脑卒中后明显激活了线粒体凋亡通路，引起了缺血区域脑组织神经元凋亡的发生。

2 p53/CytC/Apaf-1与线粒体凋亡通路

线粒体凋亡通路是caspase依赖性的重要细胞凋亡机制，以线粒体为靶的蛋白分子以不同的途径影响线粒体的功能，使细胞最终凋亡。它们有的在线粒体膜上形成孔道致使线粒体肿胀；有的增加线粒体膜的通透性，使凋亡效应因子从线粒体漏出；有的通过降低线粒体膜电位使其通透性增加，进而诱导凋亡。而p53/CytC/Apaf-1线粒体凋亡通路就是通过增加线粒体膜的通透性，从而诱导细胞凋亡发生。

2.1p53的结构与作用 p53是一种肿瘤抑制基因，由16～20 kb组成，是一个由393个氨基酸组成的含磷蛋白，相对分子质量约53，简称p53。p53是目前公认的促凋亡基因，在细胞凋亡过程中发挥了重要作用。p53可通过上调促凋亡蛋白Bax、Puma、Noxa、Bid、PTEN、Fas/CD95，下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl，来诱导细胞凋亡的发生；也可直接在细胞质膜聚集激活促凋亡蛋白Bax而触发细胞凋亡；还可以和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl 形成复合物直接诱导线粒体外膜通透性增加，导致CytC释放〔12〕，激活caspase级联反应，引起细胞凋亡的发生。

p53在缺血性脑卒中引发神经细胞凋亡过程中发挥了重要作用，它是抑制神经细胞凋亡的关键靶点〔13，14〕。大脑缺血缺氧均可促进p53表达，通过多种形式引起促凋亡蛋白Bax表达增多，抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降，进而激活caspase级联反应，促使神经细胞凋亡〔15〕。Young Park等〔16〕应用SH-SY5Y细胞，建立缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)模型，模拟缺血性脑卒中神经元损伤环境，探讨金纳米颗粒对缺血性脑卒中的神经保护作用。研究发现，给予OGD/R处理后，模型组细胞p53、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9等凋亡相关蛋白的表达明显升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降，当给予金纳米颗粒治疗后，p53、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9等凋亡相关蛋白的表达明显下降，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达显著提高，并且SH-SY5Y细胞活性明显升高，有效发挥了神经保护作用，表明p53介导的线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中病理进程中扮演着重要角色。

2.2CytC的结构与作用 CytC是分子量为13 kD左右的核编码蛋白，由105个氨基酸组成，是水溶性线粒体膜蛋白。生理状态下，CytC存在于线粒体的内膜外侧，无法穿过线粒体外膜释放至胞质，当细胞受到凋亡信号因子刺激后，CytC在唯BH3结构域蛋白辅助下易位到线粒体膜上，经线粒体膜通透转换孔进入细胞质，在dATP存在的条件下，与胞质中的Apaf-1蛋白相结合，诱导caspase-9活化，引起细胞凋亡〔17〕。研究发现，CytC从线粒体释放到细胞质是多种细胞凋亡方式的共同表现，它是线粒体凋亡通路中不可缺少的重要因子〔18〕。

当细胞受到缺血、缺氧等外界条件刺激时，促凋亡因子将通过破坏线粒体外膜，促使活性氧、自由基等信号因子刺激线粒体内膜小孔开放，使细胞自身发生应激性改变，水和溶质等小分子物质进入线粒体基质，导致线粒体膨胀，内膜的膨胀导致外膜的破裂，破坏了线粒体膜完整性，使包括CytC在内的多种凋亡蛋白释放入胞质〔19〕，最终引发细胞程序性死亡。Zhao等〔20〕应用小鼠海马神经元OGD和小鼠全脑缺血性损伤模型，在细胞和动物水平，分别探讨了Ngn2对缺血性脑卒中的神经保护作用。结果发现，给予OGD和全脑缺血处理后，模型组CytC的释放明显增多，Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表达明显增多，给予Ngn2处理后，CytC的释放显著减少，Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表达显著降低，有效减轻了OGD诱导的小鼠海马神经元损伤和脑缺血小鼠脑梗死体积，表明CytC介导的线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中病理进程中发挥了重要作用。

2.3Apaf-1的结构与作用 Apaf-1是一种分子量为130 kD的胞质蛋白，存在于细胞质中，包含1 194个氨基酸残基。按照自身结构的不同Apaf-1分为3种结构域：CARD结构域、CED-4同源结构域、WD-40结构域。当CytC和dATP存在的条件下，Apaf-l构象发生改变，WD-40结构域移位，暴露其CARD结构域，通过CARD-CARD亲和作用与Procaspase-9的CARD结构域相结合，诱导caspase-9的活化，从而启动caspase级联反应〔21，22〕。

Apaf-1作为线粒体介导细胞凋亡通路中的重要因子与神经元凋亡密切相关，它是形成凋亡体的核心，在激活caspase级联反应中起枢纽作用〔23，24〕。Vaibhav等〔25〕通过建立脑缺血再灌注损伤模型，模拟缺血性脑卒中损伤环境，探讨了姜油酮对脑缺血再灌注损伤大鼠神经保护作用。模型组大鼠脑梗死体积明显增加，线粒体损伤显著，促凋亡蛋白Apaf-1、Bax、caspase-3、caspase-9表达明显升高。给予姜油酮处理后，促凋亡蛋白Apaf-1、Bax、caspase-3、caspase-9表达显著降低，大鼠脑梗死体积明显减小，研究表明，表明了Apaf-1介导线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中病理进程中发挥了重要作用。

2.4p53/CytC/Apaf-1介导线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中的作用 p53被认为是细胞凋亡连锁反应中的第一个关键因素，在调节缺血缺氧引起的细胞损伤时发挥着关键作用〔13,26〕。当缺血性脑卒中发生后，线粒体功能障碍，此时，p53则在细胞质膜发生聚集，激活了多结构域促凋亡蛋白Bax〔27〕，使得Bax与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，从而介导CytC的释放，p53也可以直接作用于线粒体膜，诱导CytC释放入胞质，与胞质中的Apaf-1结合，从而激活下游凋亡蛋白caspase-9/-3，引起caspase的级联反应〔18〕，最终诱导细胞凋亡。

Gao等〔28〕应用转基因小鼠靶向抑制Apaf-1的表达，初步观察了抑制Apaf-1介导的线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中小鼠的神经保护作用。研究发现，利用转基因小鼠靶向抑制Apaf-1，显著降低了胞质中CytC的表达，抑制了凋亡蛋白caspase-9/-3活化，有效改善了缺血性脑卒中小鼠神经功能障碍。Xie等〔11〕采用大鼠脑缺血再灌注损伤模型，模拟缺血性脑卒中脑损伤环境，并注射p53抑制剂(PFT-α)，观察了p53/CytC/Apaf-1线粒体凋亡通路，在缺血性脑卒中大鼠神经损伤中的作用。研究发现，模型组大鼠脑梗死体积明显增大，p53、Bax、CytC、caspase-3的蛋白表达量明显提高，给予p53抑制剂后，p53、Bax、CytC、caspase-3的蛋白表达量明显降低，大鼠脑梗死体积明显减小，表明了抑制p53/CytC/Apaf-1线粒体凋亡通路的激活，对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，给缺血性脑卒中的治疗具有重要意义。Wen等〔29〕利用SD大鼠建立脑缺血再灌注损伤模型，模拟缺血性脑卒中损伤环境，观察了缺血性脑卒中大鼠脑梗死体积、神经细胞凋亡率及p53、Bax、Bcl-2、CytC和caspase-3的蛋白表达，探讨了NDRG4基因在调节细胞凋亡和预防脑缺血再灌注损伤中的新作用，研究发现， NDRG4基因可以抑制p53的表达和活性，从而降低神经细胞凋亡率，减少脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积，降低p53、Bax、Bcl-2、CytC和caspase-3的蛋白表达。此外，Kotipatruni等〔30〕研究发现，NDRG4基因的下调可以激活p53，增加Bax的表达及转运至线粒体膜，促使CytC释放，从而活化线粒体凋亡通路，导致细胞凋亡的发生。这些都提示了p53/CytC/Apaf-1介导的线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中病理进程中扮演了重要角色。如果能够有效抑制p53/CytC/Apaf-1介导的线粒体凋亡通路，将对缺血性脑卒中的治疗提供重大帮助。

3 小结与展望

缺血性脑卒中是一种临床上常见脑血管疾病，尤其高发于60岁以上老年人。缺血性脑卒中发生后，可引起线粒体功能障碍，导致线粒体肿胀，线粒体膜通透性增加，促凋亡相关因子表达增强，引发线粒体途径细胞凋亡。线粒体凋亡通路在缺血性脑卒中发生后被激活，在脑缺血区域引起细胞凋亡的级联反应，破坏神经元功能，造成严重的脑组织损伤。p53/CytC/Apaf-1是线粒体凋亡通路中的经典途径，在缺血性脑卒中神经细胞凋亡过程中发挥着重要作用。p53是一种特异性的转录因子，作为凋亡发生的起始因素，可诱导多种促凋亡蛋白转移至线粒体膜，使其通过线粒体膜通道转换孔进入细胞质，凋亡相关因子CytC就是其中一种促凋亡因子，它是线粒体凋亡通路中的关键一环，其进入胞质后，与凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1的羧基端结合，使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-CytC-Procaspase-9多聚复合体，进而激活caspase级联反应，引发脑缺血区域神经细胞凋亡的发生。而抑制p53/CytC/Apaf-1介导的线粒体凋亡通路，可有效减轻脑缺血损伤，对于防治缺血性脑卒中具有重要意义。