鲍鱼肌肉蛋白对Lewis 肺癌化疗小鼠短期营养支持作用研究

任鼎鼎，郑惠娜，2，3，4*，李晋祯，曹文红，2，3，4，林海生，2，3，4，秦小明，2，3，4

（1 广东海洋大学食品科技学院 广东湛江524088 2 广东海洋大学深圳研究院 广东深圳518108 3 国家贝类加工技术研发分中心（湛江）广东省水产品加工与安全重点实验室广东省海洋生物制品工程实验室 广东湛江524088 4 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 大连工业大学 辽宁大连 116034）

营养不良对癌症患者有很强的负面影响，容易导致机体状态和生活质量下降，从而提高感染疾病以及增加死亡的风险，延长住院时间[1]。因此，营养支持对患者的生存和发展起着重要的作用[2]。有研究表明，在癌症模型中，补充牛肉提取物可以通过调节能量储存和抗氧化性，改善因化学疗法引起的身体器官和体重减轻、疲劳以及毒性作用[3]。牡蛎多糖可以有效改善5-氟尿嘧啶（5-FU）引起的肠道黏膜损伤以及营养不良，纠正荷瘤小鼠的蛋白代谢，改善人体能量消耗以及化疗患者的身体状况[4]，同时，营养支持对化疗后临床患者也具有重要的作用。Zhang 等[5]研究显示增加蛋白质的摄入以及免疫营养物质可减少患者术后并发症及缩短住院时间。Lin 等[6]研究表明及时给予营养支持可以维持化疗患者的体重，并提高化疗效果。Mele 等[7]研究显示，改善患者营养状况可以减少术后并发症和住院时间，从而降低患者及医院成本。由此，可以看出，在肿瘤患者化疗过程中，适当的营养支持可以改善肿瘤患者的营养状况，缩短机体恢复时间。

皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai），又称“腹鱼”，是软体动物门单壳贝类的一种。我国鲍鱼产量极为丰富，2020 年，中国的鲍鱼养殖产量为203 485 t，比2019 年增长12.88%[8]。鲍鱼蛋白质含量高达19.89%，脂肪含量为0.13%，氨基酸种类较为丰富（17 种）且含量较高（最高达18.12 g/100 g），8 种必需氨基酸含量可达5.08 g/100 g，同时还含有棕榈酸、EPA、DHA、维生素以及微量元素等，具有较高的营养价值[9]。鲍鱼肉质嫩滑、味道鲜美，深受广大消费者喜爱[10]。

本研究通过构建Lewis 肺癌化疗小鼠模型，以鲍鱼肌肉全蛋白为原料对化疗后肺癌小鼠进行营养支持，为开发肿瘤患者营养支持相关特医食品提供理论基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 皱纹盘鲍11～12 月购自湛江市霞山区东风批发市场，规格70 g 左右；将新鲜鲍鱼去除壳和内脏，清洗打浆，打浆后在-45 ℃下冷冻干燥，保存备用。

1.1.2 试剂 顺铂（抗肿瘤药物），中国山东齐鲁制药有限公司；磷酸缓冲盐溶液（PBS）、南美胎牛血清、DMEM 培养基、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶，购自美国Gibco 公司；血红蛋白（Hemoglobin，Hb）试剂盒、白蛋白（Albumin，ALB）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；前白蛋白（Prealbumin，PA）Elisa 试剂盒，购自江苏酶免实业有限公司；生理盐水、医用酒精，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CKX41 型倒置显微镜，日本Olympus 公司；MCO-175 CO2培养箱，三洋（日本）公司；SW-CJ-2FD 型双人超级操作台，苏州净化设备有限公司；DM2000LED型显微镜，德国Leica公司；Cary60UV-Vis 紫外-可见分光光度计，美国Agilent Technologies 公司；Varioskan Flash 多功能酶标 仪，美国Thermo Fisher Scentific 公司；Microfuge 22R Centrifuge 型低温高速离心机，美国Beckman Coulter公司；Countstar IC1000 全 自 动细胞计数仪，北京众力挽生物科技有限公司；数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；立式压力灭菌锅，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；艾瑞泽电子游标卡尺，青岛易购五金工具有限公司；JYL-CO12 九阳料理机，山东九阳股份有限公司；Eyela FD-5N 真空冷冻干燥机，日本Tokya Rikakikai 有限公司

1.3 方法

1.3.1 实验动物及细胞 C57BL/6 雌性小鼠，6 周龄，体质量为（20±2）g，由济南鹏悦试验动物繁育有限公司提供，小鼠全部在无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）级环境中分笼饲养，适应性喂养1 周后进行正式实验，动物房12 h 明暗循环，温度为（22±1）℃，湿度为60%～70%，整个实验过程中小鼠自由饮食饮水。实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003，实验动物使用许可证编号：SYXK（粤）2019-0204（广东海洋大学SPF 级动物实验室）。

Lewis 肺癌细胞（LLC）购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。将购买的细胞拆掉包装，培养瓶放置于37 ℃的CO2培养箱，静置1～2 h，镜下观察，同时进行拍照。待细胞稳定且生长状态较好便可进行传代。

1.3.2 Lewis 肺癌化疗小鼠模型的建立 取生长状态良好的Lewis 肺癌细胞（LLC），用PBS 将细胞密度调为1×107个/mL，右腋下（每只小鼠0.1 mL）进行注射接种[11]。建立模型后，用不同质量浓度（0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.20 mg/mL）顺铂进行注射，以生长指标（体质量、肿瘤体积、抑瘤率、免疫器官）和营养指标（血清ALB、PA、Hb 水平）为依据，优选最佳化疗质量浓度，建立化疗小鼠模型。

1.3.3 Lewis 肺癌化疗小鼠营养支持分组 参考文献[12]的方法进行一定修改，将成功建模的小鼠随机分组，每组12 只。对小鼠进行连续12 d 的营养支持。实验分组：空白对照组（NT）灌胃生理盐水；鲍鱼肌肉全蛋白粉低、中、高剂量组（AMPPLD、AMPP-MD、AMPP-HD，分别灌胃AMPP 15，30，60 g/kg；阳性瑞能组（PC-RN）根据产能比计算得到灌胃质量浓度为0.585 g/mL；阳性乳清蛋白组（PC-RQ），灌胃质量浓度为0.585 g/mL。所有组分每只小鼠每天灌胃剂量为0.2 mL。

1.3.4 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠营养支持后一般情况观察及存活率 观察接种Lewis 肺癌细胞后的小鼠精神状态、体质量变化、进食情况以及体表特征，记录每组小鼠的存活数量并计算存活率。

1.3.5 Lewis 肺癌化疗小鼠营养支持后体质量、有效体质量、体质量变化及有效体质量变化 采用电子天平对肺癌化疗小鼠进行体质量监测，对处死后小鼠的体质量和瘤体质量进行测定并记录。

1.3.6 Lewis 肺癌化疗小鼠营养支持后肿瘤体积、瘤体质量及抑瘤率的变化

1.3.6.1 肿瘤体积的变化 用游标卡尺对小鼠肿瘤的最大长径和最小短径进行测量（2 d 一次），并绘制肿瘤生长曲线。

1.3.6.2 瘤体质量及抑瘤率的变化 眼球取血后处死小鼠，从小鼠身上完全剥离瘤体，用电子天平对其精确称量，记录瘤体质量。

1.3.7 Lewis 肺癌化疗小鼠营养支持后脏器指数的变化 眼球取血后处死小鼠，进行解剖，取出脾脏和胸腺，对其进行称量后计算脏器指数。

1.3.8 Lewis 肺癌化疗小鼠营养支持后营养指标的测定

1.3.8.1 血清处理 末次营养支持24 h 后，进行眼球取血并脱颈处死。将血液样本放置于离心管中，室温静置4 h 后3 000 r/min 离心5 min，取上清液分装于离心管中，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.8.2 血清ALB 含量的测定 参考试剂盒说明书，ALB 用溴甲酚绿法测定。设置空白孔（即加入2.5 μL 的蒸馏水）、标准孔（即加入2.5 μL 的标准液）、测定孔（即加入2.5 μL 的样本），之后在每个孔中加入250 μL 的试剂一应用液。轻轻振荡混匀，室温静置10 min，在波长630 nm 处用酶标仪测量，ALB 含量按式（9）进行计算。

1.3.8.3 血清PA 含量的测定 根据试剂盒在波长450 nm 处测定标准曲线及样品活性；其中标准曲线回归方程为y=0.005x＋0.1244，R2=0.994。

1.3.8.4 血清Hb 含量的测定 浓缩储备试剂用蒸馏水1∶99 稀释，配成Hb 稀释液应用液（即1 mL 加蒸馏水至100 mL），充分混匀，4 ℃保存。设置空白管（加入蒸馏水0.01 mL）和测定管（待测样本0.01 mL），之后在每孔加入2.5 mL 的Hb 稀释液应用液，充分混匀，静置5 min，在波长540 nm处测定吸光度值。血清Hb 含量按式（10）计算。

血红蛋白含量（g/L）=（测定OD 值-空白OD值）×367.7 （10）

1.3.9 数据处理 采用SPSS 24.0 进行显著性差异（P＜0.05）分析，两组数据之间采用独立样本t 检验进行显著性差异（P＜0.05）；实验数据采用Origin 2018 进行作图，数据表示为（），多样本比较采用单因素方差分析法（ANOVA）分析。

2 结果与分析

2.1 顺铂化疗质量浓度筛选

2.1.1 Lewis 肺癌小鼠模型的建立 在雌性C57BL/6 小鼠右腋下注射Lewis 肿瘤细胞，小鼠生长状态良好，无不良反应。5 d 后可以触摸到绿豆大小的肿块；接种7 d 后，接种部位可明显看到肿瘤组织。形态大多呈椭圆形或圆形，大小不一，小鼠成模率为100%。

图1 Lewis 肺癌小鼠实体瘤模型的构建Fig.1 The construction of a solid tumor model of Lewis lung cancer mouse

2.1.2 不同化疗质量浓度对肺癌小鼠存活率的影响 表1 显示了不同化疗质量浓度下Lewis 肺癌小鼠的存活情况，与对照组对比，化疗质量浓度为0.02 mg/mL 和0.04 mg/mL 的肿瘤小鼠无死亡现象，存活时间最长，而其它化疗质量浓度的肿瘤小鼠在化疗结束后均有不同程度的死亡，0.06 mg/mL化疗后的肿瘤小鼠的存活率为37.5%，0.08，0.10 mg/mL 以及0.20 mg/mL 化疗后的肿瘤小鼠在化疗第6 天全部死亡。有研究表明，化疗浓度较高时会增加肾脏毒性风险，从而影响小鼠的发病率和死亡率[13]。本研究结果显示顺铂不仅影响Lewis 肺癌小鼠的存活率，且具有剂量依赖性。在实验过程中发现化疗质浓度为0.02 mg/mL 的肿瘤小鼠生命特征优于0.04 mg/mL 的小鼠。因此，选用0.02 mg/mL 作为最佳化疗质量浓度。

表1 不同化疗质量浓度Lewis 肺癌小鼠存活率（n=8）Table 1 Survival rate of Lewis lung cancer mice with different chemotherapy mass concentrations（n=8）

2.1.3 不同化疗质量浓度对肺癌小鼠免疫器官的影响 脾脏和胸腺是最重要的免疫器官，在一定程度上不仅可以反映机体免疫功能的强、弱还可以反映营养物质的吸收情况[14]。由图2 所示，与NT 组相比，0.02 mg/mL 和0.04 mg/mL 顺铂化疗后小鼠的脏器指数均明显降低（P＜0.05），且具有剂量依赖性。本实验结果表明，顺铂对Lewis 肺癌小鼠的免疫器官有一定的损伤作用，明显降低了免疫器官的质量[15]。然而，0.02 mg/mL 和0.04 mg/mL化疗后的免疫器官结果显示没有显著性差异（P＞0.05）。

2.1.4 不同化疗质量浓度对Lewis 肺癌小鼠营养指标的影响 ALB 是营养代谢的敏感性指标，营养状态与机体的免疫功能有着密不可分的联系[16]。由图3 可以看出，与NT 组对比，0.02 mg/mL 和0.04 mg/mL 化疗处理的肺癌小鼠血清ALB 含量虽降低，但无显著性差异（P＞0.05），可能是因为肿瘤小鼠在化疗后出现营养不良，从而导致ALB 表达量降低，与蒋妍等[17]的研究结果一致。

PA 由肝细胞合成，半衰期短，能更快地反映营养摄入量正或负平衡，是目前国际上评价营养状况和监测营养支持效果的一种血清蛋白质[18-19]。由图3b 可以看出，0.02 mg/mL 化疗后肿瘤小鼠的血清PA 水平略微升高且无显著性差异（P＞0.05）；而0.04 mg/mL 化疗后肿瘤小鼠的血清PA水平下降，且无显著性差异（P＞0.05）。机体患有肿瘤时，其血浆水平会明显下降，影响免疫功能[20]；同时，化疗药物的副作用会产生应激反应，进一步破坏免疫系统[21]。

Hb 是机体运送氧的主要蛋白，可以反映机体代谢水平，是反映营养状态的重要指标[22]。由图3c 可以看出，与NT 组相比，0.02 mg/mL 和0.04 mg/mL 化疗后肺癌小鼠的血清血红蛋白含量不断降低，且具有显著性差异（P＜0.05）。实验中0.02 mg/mL 化疗后小鼠的生命特征优于0.04 mg/mL，根据实验需求，选择0.02 mg/mL 顺铂为Lewis 肺癌化疗小鼠的最佳化疗质量浓度。

图3 顺铂对Lewis 肺癌小鼠营养指标的影响Fig.3 The effect of cisplatin on nutritional indicators of Lewis lung cancer mice

2.2 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠的营养支持

2.2.1 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠的体质量、有效体质量、体质量变化及有效体质量变化的影响 体质量是肿瘤病人最常用的营养指标，蛋白质和热量摄入不足会导致肿瘤病人体重降低[23]。由图4 可以看出，在整个实验周期，各组小鼠体质量不断增加。进行营养支持后，与NT 组对比，各组小鼠的体质量均低于NT 组。

图4 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠体质量的影响Fig.4 The effect of AMPP on the body weight of Lewis lung cancer chemotherapy mice

由表2 可以看出，使用AMPP 对Lewis 肺癌小鼠进行营养支持后发现，处死时的各组小鼠体质量较首次营养支持时的体质量明显增加；与NT 组相比，处死时各组小鼠体质量和小鼠有效体质量无显著性差异（P＞0.05）。与NT 组相比，PC-RN 组小鼠的有效体质量变化有显著性差异（P＜0.05），可能是因为化疗后小鼠身体机能受到影响导致小鼠营养不良，从而表现为体质量下降。与Grobler 等[24]研究食物或营养补充能够增加患者的体重的结果一致。

表2 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠体质量变化的影响（n=10）Table 2 The effect of AMPP on the weight change of Lewis lung cancer chemotherapy mice（n=10）

2.2.2 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠免疫器官的影响 脾脏和胸腺是最重要的免疫器官，在一定程度上直接反映机体免疫功能的强、弱[25]。脏器指数不仅可以反映内脏功能强、弱还可以反映营养物质的吸收情况[14]。如图5 所示，与NT 组对比，AMPP-LD、AMPP-HD 组对小鼠的脾脏指数略微升高，而AMPP-MD 降低，且各组差异均无统计意义（P＞0.05）。与NT 组对比，AMPP-MD、AMPPHD 组对小鼠胸腺指数虽明显高于NT 组，但无统计学意义（P＞＞0.05），表明AMPP 对机体免疫器官的影响较小，与赵凯丽[26]研究的结果一致，出现这种现象的原因可能是AMPP 短期内对小鼠机体免疫功能作用不明显。

图5 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠免疫器官的影响Fig.5 The effect of AMPP on the immune organs of Lewis lung cancer chemotherapy mice

2.2.3 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠肿瘤体积、瘤体质量以及抑瘤率的影响 由图6 可以看出，与NT 组相比，各组分肿瘤体积总体呈升高的趋势。从整个营养周期来看，AMPP-LD 组小鼠的肿瘤体积增长最大，为5 133 mm3。AMPP-HD 组小鼠的肿瘤体积增长最小，为3 900 mm3，与刘丹等[27]的研究结果一致，说明在给予肿瘤小鼠营养支持后，不会促进肿瘤的生长。

图6 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠肿瘤体积的影响Fig.6 The effect of AMPP on tumor volume in Lewis lung cancer chemotherapy mice

由表3 可知，与NT 组相比，各组瘤体质量没有显著性差异（P＞0.05）。AMPP-MD 平均瘤重最小，为（5.09±2.16）g，抑瘤率为20.7%。PC-RN 组小鼠的平均瘤重为（7.60±1.44）g，抑瘤率为-18.4%，由此说明与NT 组对比，PC-RN 组的瘤体质量大于NT 组。此结果与段明珉等[28]的研究结果一致，出现不显著的原因可能是使用鲍鱼肌肉蛋白粉进行营养支持后会导致小鼠进食差、代谢增快而影响效果，很难在短时间内提高小鼠的免疫力。

表3 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠肿瘤质量和抑瘤率的影响Table 3 Effects of AMPP on tumor weight and tumor inhibition rate in Lewis lung cancer chemotherapy mice

2.2.4 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠营养指标的影响 由图7a 可以看出，与NT 组相比，AMPP 不同剂量组的ALB 高于NT 组（P＞0.05），可能是因为化疗后导致蛋白合成减少，而ALB 的半衰期较长，对其进行营养支持的时间较短，因此短期白蛋白水平的变化不明显[29]。AMPP-MD 组的ALB 最高说明AMPP-MD 组对肺癌化疗小鼠ALB 影响最大，此结果与抑瘤率呈正相关。由图7b 可以看出，与NT 组对比，AMPP 组PA 明显高于NT 组，且AMPP-LD 具有显著性差异（P＜0.05），说明AMPP 进行营养支持后改善了化疗小鼠的营养状况，这与李伟等[30]的研究结果一致。营养支持后PA 质量浓度迅速升高，较ALB 更能及时地反映机体的营养状况，而ALB 和PA 出现不一致的原因可能是其两种蛋白的半衰期不同，对营养支持的敏感性存在差异[31]。由图7c 可以看出，与NT 组对比，AMPP 组的Hb 明显降低，且具有显著性差异（P＜0.05），可能是因为化疗后导致Hb 下降，同时随着化疗周期以及质量浓度的增加，Hb 更低，表明肿瘤小鼠处于营养不良的状态，贫血可导致肿瘤组织缺氧，使肿瘤细胞的基因、蛋白质组和基因组发生变化，进而增强肿瘤的侵袭[32]。

图7 AMPP 对Lewis 肺癌化疗小鼠营养指标的影响Fig.7 The effects of AMPP on nutritional indicators of Lewis lung cancer chemotherapy mice

3 结论

本实验结果表明，顺铂化疗后的肿瘤小鼠，其身体机能以及营养状况被明显抑制，结合小鼠身体机能的变化，确定Lewis 肺癌小鼠的最佳化疗质量浓度为0.02 mg/mL。使用AMPP 进行营养支持后，可明显增加小鼠的体质量、肿瘤体积等；与NT 组对比，各剂量组的AMPP 均能提高化疗小鼠的血清ALB、PA 及Hb 水平。由此得出，AMPP 对肺癌化疗小鼠的营养状况具有明显地改善作用，由于营养状况受多种因素的影响，不同个体之间机体的消耗程度也有差异，因此采用3 种指标，综合考虑进行营养评估。本研究结果为开发肿瘤患者营养支持相关特医食品研究提供理论基础依据。