大孔树脂纯化灵芝子实体和孢子粉中总三萜

祝朋玲，张静，李思雨，崔馨戈，袁抒捷，王雯，彭灿，2，3，4，5*，周俊

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中医药研究院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012；5.省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 230012；6.安徽黄山云乐灵芝有限公司，安徽 宣城 242600）

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种具有极高价值的药食两用的灵芝属真菌，是我国传统的名贵中药材，最早被记载于《神农本草经》中，具有补气安神、扶正固本、延年益寿等功效[1]，2019年已被纳入“药食同源”试点工作名单。灵芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores powder，GLSP）是灵芝成熟后从真菌中排出来的椭圆形生殖细胞，包含灵芝的所有遗传物质[2]。灵芝子实体（Ganoderma lucidum fruiting body，GLFB）和孢子粉除可供药用外，还可制备成各种保健食品。现代研究表明，灵芝子实体及孢子粉中均含有三萜类、多糖、氨基酸、甾醇、生物碱等多种活性成分[3-4]，其中三萜类化合物作为灵芝的重要活性成分之一，具有保肝护肝[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、抗肿瘤[10]、抗氧化[11-12]、神经保护[13]等多种药理活性，应用前景广泛。

采用乙醇浸提获得的灵芝三萜提取液中仍存有大量的杂质，在对灵芝三萜进行成分分析和活性研究时会产生一定的干扰作用，因此需要对灵芝三萜进一步分离纯化。到目前为止，对灵芝三萜类成分的研究多为提取工艺及药理活性[14-16]，而鲜见针对灵芝子实体和孢子粉总三萜的分离纯化研究。大孔树脂是一种具有多孔立体结构的高分子吸附剂，具有选择性高、吸附能力强、富集效果好、再生简单、使用周期长等诸多优点，被广泛应用于三萜等天然产物的分离纯化[17]。但目前不同型号的大孔树脂对不同中药中成分吸附与解吸性能不同，纯化工艺也存在差异[18-20]。因此，在前期研究的基础上，考察不同大孔树脂分别对同源灵芝子实体和孢子粉总三萜粗提取物的吸附与解吸性能，确定最佳树脂类型，优化分离纯化灵芝总三萜的工艺条件，为灵芝三萜后续的深入研究和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝（Ganoderma lucidum）：安徽省旌德县安徽黄山云乐灵芝有限公司，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为多孔菌科赤芝子实体及孢子粉。无水乙醇（分析纯）：江苏强盛功能化学股份有限公司；冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯（均为分析纯）：上海润捷化学试剂有限公司；高氯酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；齐墩果酸标准品（纯度：HPLC≥98%，批号：CHB171229）：成都克洛玛生物科技有限公司；HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、AB-8、NKA-9、D101 型大孔树脂：北京瑞达恒辉科技发展有限公司；HPD-826型大孔树脂：郑州和成新材料科技有限公司。

1.2 仪器与设备

千分之一分析天平（BSA224S-CW）、十万分之一分析天平（BT25S）：北京赛多利斯科学仪器有限公司；恒温水浴锅（DF-101S）：上海越众仪器设备有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-8000）：上海元析分析仪器有限公司；高速离心机（TG16-WS）：常州市万丰仪器制造有限公司；恒温培养振荡器（ZWY-2102C）：上海智诚分析仪器制备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 上样液制备

取干燥的灵芝子实体粗粉和孢子粉（干样）各200g，分别加入无水乙醇回流提取两次，料液比为1∶20（g/mL），每次1.5 h，温度50℃，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，得干样含量0.2 g/mL的储备液，保存备用。

1.3.2 灵芝子实体和孢子粉总三萜的浓度测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制

精密称取齐墩果酸标准品10.00 mg，用无水乙醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，保存备用。精密量取标准品溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0、2.6 mL于10 mL试管中，于50℃烘箱中挥干乙醇，放冷，精密加入0.2 mL 50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸溶液，混匀，于70℃水浴加热15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，在548 nm波长处测定吸光度（A）。以A为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，计算得线性回归方程：A=29.503C+0.0208，R2=0.9970，线性范围为 4 μg/mL～104 μg/mL。

1.3.2.2 样品中总三萜浓度测定

吸取灵芝子实体和孢子粉乙醇提取液0.1 mL，于50℃烘箱中挥干乙醇，放冷，其余步骤同1.3.2.1。根据1.3.2.1中标准曲线回归方程计算灵芝子实体和孢子粉乙醇提取液中总三萜浓度。

1.3.3 树脂的预处理和含水量的测定

准确称取一定量的 HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101 型大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶胀后，倒出乙醇及漂浮物，湿法装柱。继续用95%乙醇冲洗树脂柱，直至流出的乙醇洗脱液与蒸馏水（体积比为1∶1）混合无浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味，且树脂排列均匀，备用。

取少量大孔树脂，照2020版《中国药典》附录ⅨH水分测定法项下第一法-烘干法测定树脂含水量。

1.3.4 大孔树脂的静态吸附与解吸

1.3.4.1 静态吸附曲线的绘制

精密称取预处理过的8种大孔树脂，每份相当于相应的干树脂2.00 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入20 mL灵芝子实体和孢子粉上样液（相当于0.1 g干样/mL），每 10 min 振摇 1 次，每次 10 s，持续 2 h，并于 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00 h吸取上清液1 mL，按1.3.2方法测定吸光度。计算不同时间各树脂对灵芝总三萜的吸附量，并绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.4.2 静态吸附-解吸试验

分别精密量取灵芝子实体和孢子粉上样液10 mL（相当于0.5 g干样/mL）各9份，加到预处理好的各型号大孔树脂中，静态吸附8 h，吸取上清液1 mL，按1.3.2方法测定吸光度，计算灵芝总三萜的浓度。静态吸附后的各型号大孔树脂过滤后，先用适量的蒸馏水冲洗，抽干，置于250 mL具塞锥锥形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL于振荡器中，振荡12 h，过滤，95%乙醇定容至100 mL，精密量取各滤液1 mL，按1.3.2方法测定吸光度。按公式（1）～（4）计算静态吸附量、吸附率、解吸率和回收率。

式中：Q为静态吸附量，mg/g；C0为上样液中总三萜浓度，mg/mL；C1为静态吸附后上清液的总三萜浓度，mg/mL；V 为上样液体积，mL；W 为干树脂质量，g；G 为吸附率，%；C3为解吸后溶液中总三萜浓度，mg/mL；D为解吸率，%；R为回收率，%。

1.3.5 大孔树脂纯化灵芝子实体和孢子粉总三萜工艺优化

1.3.5.1 上样液浓度的选择

准确称取预处理好的HPD-500和AB-8型大孔树脂各5份（均相当于干大孔树脂4 g），采用湿法装柱，HPD-500大孔树脂柱床体积（bed volume，BV）为27 mL，AB-8型大孔树脂柱床体积为25 mL。分别制备浓度为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0g干样/mL 的上样液各 10mL，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV的水冲洗，再换用4BV的95%乙醇冲洗，收集洗脱液，测定总三萜浓度，计算吸附率和总三萜转移率（总三萜转移率/%＝洗脱液中总三萜质量／上样液中总三萜质量×100），以确定最佳上样液浓度。

1.3.5.2 上样量的选择

准确称取预处理好的HPD-500和AB-8型大孔树脂各5份（均相当于干大孔树脂4 g），采用湿法装柱。精密吸取1.0 g干样/mL灵芝子实体的上样液和0.4 g干样/mL灵芝孢子粉的上样液各100 mL，以2 mL/min的流速上柱，每5 mL收集一份流出液，并测定每份流出液中的总三萜浓度。以流出液份数为横坐标，流出液中总三萜浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线。

1.3.5.3 最适洗脱溶剂浓度的确定

精密吸取1.0 g干样/mL灵芝子实体的上样液2 BV和0.4g干样/mL灵芝孢子粉的上样液3BV，以2mL/min的流速通过HPD-500和AB-8型大孔树脂柱，分别用蒸馏水、20%、40%、50%、60%、75%、85%和95%的乙醇进行洗脱，洗脱剂用量均为4 BV，分段收集洗脱液，测定总三萜浓度。

1.3.5.4 洗脱剂用量的考察

精密吸取1.0 g干样/mL灵芝子实体的上样液2 BV和0.4g干样/mL灵芝孢子粉的上样液3BV，以2mL/min的流速分别通过HPD-500和AB-8型大孔树脂柱，并分别用75%乙醇、95%乙醇进行洗脱，直至流出液无色，每5 mL接收1次流出液，每隔0.5 BV洗脱液测定其中总三萜浓度。

1.3.5.5 验证试验

为了考察最佳工艺条件的稳定性，在上述筛选的最佳工艺条件下，采用HPD-500和AB-8型大孔树脂分别纯化灵芝子实体和孢子粉三萜粗提物，分别进行平行试验3次。洗脱液浓缩、烘干至恒重后得到纯化产物，按照1.3.2方法测定总三萜含量。

1.4 数据处理

所有试验重复3次，采用Origin进行图表绘制，通过Excle软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂含水量

8种大孔树脂的含水量测定结果见表1。

表1 树脂含水量Table 1 Water content of resin

2.2 静态吸附曲线

8种大孔树脂对GLFB和GLSP总三萜的静态吸附曲线见图1和图2。

图1 8种大孔树脂对GLFB总三萜的静态吸附曲线Fig.1 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum fruiting body（GLFB）

图2 8种大孔树脂对GLSP总三萜的静态吸附曲线Fig.2 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum spore powder（GLSP）

由图1和图2可知，0～2 h时，8种大孔树脂对灵芝子实体和孢子粉总三萜的吸附量增大较快，2 h～8 h内随着时间延长而逐渐平缓，说明在2 h时吸附量都已基本达到平衡，大孔树脂对灵芝总三萜的吸附量趋于饱和。其中HPD-300和HPD-500型大孔树脂对灵芝子实体总三萜的吸附量在2 h后的吸附量略高于其他树脂；而AB-8型大孔树脂对灵芝孢子粉总三萜的吸附量高于其他树脂。

2.3 大孔树脂静态吸附与解吸附效果

8种大孔树脂的相关物理参数及对灵芝总三萜的静态吸附与解吸效果见表2。

表2 8种大孔树脂的相关物理参数及对灵芝总三萜的静态吸附与解吸效果Table 2 Physical parameters and absorption-desorption performance of eight macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum

大孔树脂的吸附作用来源于与被吸附物质树脂之间的范德华力和氢键，两者之间的相互作用是一个物理过程，并且其极性、比表面积、孔径也会影响树脂吸附和解吸。由表2可知，较大比表面积、孔径较小、非极性的HPD-300和HPD-500型大孔树脂对灵芝子实体总三萜的吸附性能较好，但从解吸率和回收率考察可知HPD-500型大孔树脂的解吸率和回收率均高于HPD-300型大孔树脂，这可能是由于HPD-500型大孔树脂与灵芝子实体中三萜类成分有较好的相互作用有关。对于灵芝孢子粉总三萜而言，弱极性的AB-8型大孔树脂在吸附性能、解吸率以及回收率方面均高于其他7种型号的大孔树脂，且高于对灵芝子实体三萜的吸附、解吸效果，这可能与灵芝孢子粉三萜与子实体三萜的极性不同有关。因此，综合静态吸附曲线结果，选择HPD-500型大孔树脂为灵芝子实体总三萜分离纯化的最佳树脂，AB-8型大孔树脂作为灵芝孢子粉总三萜分离纯化的最佳树脂。

2.4 大孔树脂纯化灵芝子实体和孢子粉总三萜工艺参数的确定

2.4.1 上样液浓度的确定

灵芝子实体和孢子粉上样液浓度对树脂吸附性能的影响见图3、图4。

图3 GLFB上样液浓度对树脂吸附性能的影响Fig.3 Effect of GLFB sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin

图4 GLSP上样液浓度对树脂吸附性能的影响Fig.4 Effect of GLSP sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin

由图3和图4可知，随上样液浓度的增加，HPD-500型大孔树脂对灵芝子实体中三萜类成分的吸附率在逐渐减小，但减幅较小，但随上样液浓度的增加，灵芝子实体的总三萜转移率呈先升高后降低的趋势。当灵芝子实体的上样液浓度为1.0 g干样/mL时，总三萜转移率达到最大值83.72%；而AB-8型大孔树脂对灵芝孢子粉中三萜类成分的吸附率在0.1 g干样/mL～1.2 g干样/mL范围内波动较小，总三萜转移率随上样液浓度增高也呈现先升高后降低的趋势，但在0.4 g干样/mL时就达到最大值87.27%。上样液浓度较低，大孔树脂的吸附效果不能被充分利用造成浪费，但上样液浓度过大会使上样液中溶质无法充分溶解，甚至会造成树脂堵塞，不利于后续的解吸。因此，灵芝子实体的上样液浓度选择1.0 g干样/mL，而孢子粉的上样液浓度选择0.4 g干样/mL。

2.4.2 上样量的确定

HPD-500型大孔树脂对GLFB和AB-8型大孔树脂对GLSP吸附总三萜的动态吸附曲线见图5。

图5 HPD-500型大孔树脂对GLFB和AB-8型大孔树脂对GLSP吸附总三萜的动态吸附曲线Fig.5 Dynamic adsorption curves of HPD-500 for the total triterpenoids of GLFB and AB-8 for those of GLSP

由图5可知，随着上样量的增加，灵芝子实体和孢子粉的流出液中总三萜浓度均呈现先平缓后快速上升趋势。当灵芝子实体上样量低于2 BV时，灵芝子实体的流出液中总三萜浓度增幅较小，但达到2.25 BV时，流出液中总三萜浓度增大到0.30 mg/mL，并随着上样量增大而升高；当灵芝孢子粉上样量低于3 BV时，流出液中总三萜浓度变化较小，但超过3 BV时，灵芝孢子粉的流出液中总三萜浓度迅速增大。这说明灵芝子实体上样量为2 BV，孢子粉上样量为3 BV时，大孔吸附树脂吸附量基本达到饱和的状态。为避免因为过饱和导致三萜未被吸附而直接流出，从而影响分离效果，故灵芝子实体上样量选择2 BV，灵芝孢子粉上样量选择3 BV。

2.4.3 洗脱溶剂浓度的确定

经前期试验确定乙醇为最适洗脱溶剂，乙醇浓度对GLFB和GLSP总三萜洗脱效果的影响见图6。

图6 乙醇浓度对GLFB和GLSP总三萜洗脱效果的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP

由图6可知，随着乙醇浓度的增加，HPD-500型大孔树脂对灵芝子实体总三萜的解吸率呈现先升高后降低的趋势，当乙醇浓度为75%时，对HPD-500型大孔吸附树脂吸附的灵芝子实体总三萜的解吸率最大，为88.52%；而AB-8型大孔树脂对吸附的灵芝孢子粉总三萜的解吸率随着乙醇浓度的增大而逐渐升高，当乙醇浓度为95%时，对灵芝孢子粉总三萜的解吸率达到了最大，高达96.93%。这可能是由于总三萜为非极性物质，乙醇浓度升高降低了极性，三萜在低极性洗脱液中具有较高的溶解性，更容易被洗脱，因此选择灵芝子实体的洗脱溶剂为75%乙醇，而孢子粉的洗脱溶剂为95%乙醇。

2.4.4 洗脱剂用量的确定

洗脱剂用量对GLFB和GLSP总三萜洗脱效果的影响见图7。

图7 洗脱剂用量对GLFB和GLSP总三萜洗脱效果的影响Fig.7 Effect of eluent dosage on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP

由图7可知，随着洗脱剂用量的增加，灵芝子实体和孢子粉洗脱液中的总三萜浓度均呈先升高后降低的趋势，且当洗脱剂体积到达8.5 BV后，灵芝子实体和灵芝孢子粉的洗脱液中总三萜浓度基本不再变化，说明8.5 BV的洗脱液就可以将总三萜洗脱完全，故后续试验洗脱剂用量均选择8.5 BV。

2.5 验证试验

在上述优选的工艺条件下，采用HPD-500和AB-8型大孔树脂分别纯化灵芝子实体和孢子粉三萜粗提物，分别进行平行试验3次。洗脱液浓缩、冻干至恒重后得到纯化产物，测定纯化后的灵芝子实体总三萜含量分别为60.74%、59.18%及61.85%，平均值为60.59%，孢子粉总三萜含量分别为65.43%、64.35%及66.67%，平均值为65.48%，纯化效果显著。

3 结论

灵芝中的总三萜可以通过大孔树脂吸附纯化，本研究以大孔树脂对吸附率和解吸率为指标，选用HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101型8种常用的大孔树脂分别对灵芝子实体和孢子粉总三萜的静态吸附、解吸动力学进行考察，筛选出HPD-500型大孔树脂和AB-8型大孔树脂分别对灵芝子实体和孢子粉总三萜的吸附解吸效果最好。其中，HPD-500型大孔树脂纯化灵芝子实体总三萜的最佳纯化工艺条件：上样液浓度为1.0 g干样/mL，上样量为2 BV，用8.5 BV的75%乙醇进行洗脱。AB-8型大孔树脂纯化对灵芝孢子粉总三萜的最佳纯化工艺条件：上样液浓度为0.4 g干样/mL，最大上样量为3 BV，用8.5 BV的95%乙醇进行洗脱。经纯化后，灵芝子实体和孢子粉总三萜纯度分别可达到60.59%和65.48%，表明大孔树脂能够较好地去除杂质，对灵芝子实体和孢子粉中总三萜具有良好的纯化效果，是一种非常有效的分离纯化方法。该大孔树脂纯化工艺的建立为灵芝子实体和孢子粉中三萜类成分的富集和后续相关原料药制剂及保健食品的开发利用提供了新的参考依据，具有较好的应用前景。