蛹虫草芡实保健饮料的制备及其对果蝇生殖力和寿命的影响

杨立军， 刘林东， 刘敏杰， 陈 琼， 崔晨旭， 高 涵

(信阳农林学院 制药工程学院， 河南 信阳 464000)

0 引言

【研究意义】蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又称北冬虫夏草或北虫草，是一种药食同源的中草药。蛹虫草含有丰富的虫草多糖、虫草素、核苷和超氧化物歧化酶(SOD)等多种生物活性物质[1]，在抗癌、抗炎、抗氧化、降血压、防止动脉硬化和提高免疫力等方面具有良好功效[2]。芡实(Gordoneuryale)作为一种传统中药材，富含膳食纤维，糖类和蛋白质等营养成分，包括18种氨基酸及多种维生素[3]，具有调节肠道菌落平衡、降低胆固醇、增强免疫和养血安神等保健作用[4]。蛹虫草和芡实配伍都具有药食同源性，均有提高人体免疫力，健脾，益气及延缓衰老等功效[5-8]。蛹虫草不能直接食用，口感较差，难以受大众普遍接受[9]，因此，开展蛹虫草芡实保健饮料的制备及其对果蝇生殖力和寿命的影响研究，对开发配方更加科学安全的蛹虫草芡实新型保健品具有现实意义。【前人研究进展】目前，蛹虫草广泛应用于食品与保健领域。车振明[10]将蛹虫草与多种中草药配伍，研制出一种兼具抗疲劳和提高免疫力功效的复合型饮品。2008年，相继报道出蛹虫草茶、蛹虫草酸奶、蛹虫草酒和蛹虫草酱油等功能性食品[11-13]。秦秀丽等[14]通过正交试验，对蛹虫草枸杞饮品进行了生产工艺的优化；李冠龙等[15]通过正交试验确定了蛹虫草与玉米糁的最佳配比；罗帏等[16]以蛹虫草燕麦残基为原料，通过单因素和正交试验，优化了功能性乳饮料的工艺配方。【研究切入点】目前，关于芡实的研究主要集中在营养成分和药理作用方面，蛹虫草主要集中于通过正交试验筛选蛹虫草与复配物的最佳配比。有关利用蛹虫草和芡实制备保健饮料且进一步验证其食用或药用效果的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用单因素和正交试验研究蛹虫草芡实保健饮料制备的最佳配比及其对果蝇生殖力和寿命的影响，以期为蛹虫草大众食品和饮品等保健产品的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蛹虫草、果蝇及芡实 蛹虫草子实体，由信阳农林学院应用真菌实训基地提供；野生型黑腹果蝇，由信阳农林学院生物制药实验室提供；保鲜注水包装冻结芡实，河南省固始县生产。

1.1.2 试剂 α-淀粉酶(活性≥3 700 U/g)，北京奥博星生物技术有限公司生产；蜂蜜，桂林周氏顺发食品有限公司生产；白砂糖，广西海棠东亚糖业有限公司生产；食品级柠檬酸，河南万邦化工科技有限公司生产。

1.1.3 仪器设备 6202中药粉碎机，湖南中诚制药设备公司；DHG-9023AS电热恒温鼓风干燥箱，宁波东南仪器有限公司；pH计，深圳怡华电子公司；GJB30L/h-40Mpa高压均质机，常州均质设备公司；SP325破壁机，浙江苏泊尔股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

1) 蛹虫草浸提液的制备工艺。挑选优质蛹虫草，50℃烘干，粉碎至50目，按料液比1∶100(g/mL)加入蒸馏水，80℃浸提90 min，过滤取滤液。二次浸提60 min，合并2次滤液[17]，静置30 min后抽滤，得到蛹虫草浸提液。

2) 芡实滤液的制备。挑选优质芡实，除去外种皮，60℃烘干，按料液比1∶20(g/mL)加蒸馏水进行破壁磨浆，添加150 U/g α-淀粉酶(淀粉酶量按芡实碳水化合物含量为77.6%计算[18])，70℃酶解90 min。酶解前加入0.2%氯化钙作为酶活化剂[19]。酶解结束后煮沸灭酶。

1.2.2 试验设计

1) 蛹虫草浸提液与芡实滤液体积比的确定。设定蛹虫草浸提液与芡实滤液的体积比分别为3∶7、4∶6、5∶5和6∶4，以二者混合后的色泽、气味等为依据，确定饮料中蛹虫草浸提液与芡实滤液的最佳混合比例。

2) 饮料配方单因素条件优化。以饮料的感官评分为指标，确定蛹虫草浸提液与芡实滤液的体积比为3∶7，选择添加6%、8%、10%、12%、14%的蜂蜜，4%、6%、8%、10%、12%的白砂糖和0.08%、0.10%、0.12%、0.14%的柠檬酸进行单因素试验，研究各因素对保健饮料品质的影响。

3) 饮料最优配方的确定。以单因素试验为基础进行正交试验。按配方将各材料进行混合调配，将调配好的饮料液20 MPa均质8 min，以提高保健饮料的稳定性；再将均质好的饮料于100℃下杀菌20 min降低微生物的含量，以延长保质期；灭菌结束冷却至常温于无菌条件下灌装。随机抽取5瓶保健饮料进行理化及卫生质量检测；利用pH计测定饮料的酸碱度；用常规微生物学方法检测饮料中菌落总数、金黄色葡萄球菌和大肠菌群。

1.2.3 感官评价 邀请10名食品科学专业人员对饮料的色泽(20分)、气味(20分)、外观状态(20分)和口感(40分)进行评价，评分标准见表1。通过正交试验结果结合感官评价，筛选出保健饮料的最优配方。

表1 饮料感官评价标准

1.2.4 果蝇生殖力和寿命试验

1) 培养料制备。对照培养基(CK)：琼脂粉10 g，玉米粉112 g，蔗糖89 g，丙酸8 mL，酵母10 g，蒸馏水1 000 mL。试验培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别为对照培养基添加饮料至终质量分数为5%、10%、15%、20%和25%，3次重复。

2) 果蝇生殖力的测定。收集8 h内羽化未交配的黑腹果蝇，麻醉后分雌雄，将雌、雄果蝇按对饲养于上述6组培养基中，每瓶10对，每组10瓶，25℃光照培养[20]。待培养瓶中有蛹出现后转移亲本进行寿命试验。记录每瓶子一代(F1)的成蛹数和自第1只成虫孵出后7 d内F1成虫数；随机取F1代处女蝇和雄果蝇继续在相同处理培养基中饲养，每瓶3对，每组10瓶继续25℃光照培养，7 d后移去F1，记录子二代(F2)的成蛹数和自第1只成虫孵出后7 d内F2成虫数。

3) 果蝇寿命的测定。收集果蝇成虫的亲本，并将雌(♀)、雄(♂)果蝇分开培养[21]。每瓶各接入10只果蝇，每处理雌果蝇、雄果蝇各10瓶。每天统计果蝇存活数、死亡数，直至全部死亡。雌果蝇和雄果蝇半数死亡时间、平均寿命和最高平均寿命计算参照张明等[22]的方法。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 19.0对试验数据进行统计分析与绘图，用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草芡实保健饮料最优配方的确定

2.1.1 蛹虫草浸提液与芡实滤液的最佳配比 由表2看出，蛹虫草浸提液和芡实滤液的混合比例对饮料品质的影响较大。当体积比为3∶7时，感官评价得分最高(85分)，饮料为淡黄色，有淡淡的蛹虫草香味和芡实天然清香，保证了该饮料中的有效成分含量。当体积比为4∶6时，感官评价得分较高(75分)，饮料呈黄色，蛹虫草香味偏强。当体积比为5∶5时，感官评价得分较低(60分)，饮料颜色深且蛹虫草的味道过于浓郁，芡实风味极弱。当体积比为6∶4时，感官评价得分最低(50分)，饮料颜色深且蛹虫草香味过重，完全掩盖了芡实的香味。因此，蛹虫草浸提液和芡实滤液最佳混合体积比为3∶7。

表2 蛹虫草浸提液和芡实滤液不同配比混合液的感官评价结果

2.1.2 不同添加剂处理保健饮料的品质 从图1看出，不同添加剂各添加量处理蛹虫草芡实保健饮料的品质有一定差异。

图1 不同添加剂处理保健饮料的感官评价得分

1) 蜂蜜。感官评价得分随蜂蜜添加量的增加呈先升后降趋势，依次为10%(89分)>12%(83分)>8%(80分)>6%(78分)>14%(77分)。其中，添加量为8%～12%时其感官品质较好，以添加量为10%时感官评价得分最高，为89分。因此，选择添加量为8%、10%和12%的蜂蜜进行正交试验。

2) 白砂糖。感官评价得分随白砂糖添加量的增加呈先升后降趋势，依次为8%(88分)>10%(83分)>6%(82分)>4%(77分)>12%(76分)，以添加量为8%时感官评价得分最高，为88分。当添加量为6%～10%时感官评价得分较高，甜度适中；添加量过高会导致饮料过甜，整体风味变差。因此，选择添加量为6%、8%和10%的白砂糖进行正交试验。

3) 柠檬酸。感官评价得分随柠檬酸添加量的增加呈先升后降趋势，依次为0.10%(87分)>0.08%(80分)>0.12%(79分)>0.14%(77分)，以添加量为0.10%时感官评价得分最高，为87分。当添加量为0.08%～0.12%时感官评价得分较高，酸度适中；添加量过高会导致饮料有酸涩感，口感变差。因此，选择添加量为0.08%、0.10%和0.12%的柠檬酸进行正交试验。

2.1.3 蛹虫草芡实保健饮料的最优配方 由表3可知，影响饮料风味因素依次为蜂蜜添加量>柠檬酸添加量>白砂糖添加量。表明，3个因素中对饮料品质影响最大的是蜂蜜，由于蜂蜜的味道最为浓郁，加入蜂蜜使保健饮料的口感更香醇，同时可提升饮料的保健功能；其次为柠檬酸，加入柠檬酸可使饮料变得酸甜可口，提升饮料的整体风味；而添加适量的白砂糖可使饮料同时具有不同层次的甜味，后味更充足。通过对保健饮料的色泽、状态、气味和口感进行综合评价，确定饮料的最优配方组合为蛹虫草浸提液和芡实滤液体积比为3∶7，蜂蜜、白砂糖和柠檬酸的添加量分别为10%、8%和0.10%。此时，蛹虫草芡实饮料呈淡黄色，清亮，无沉淀，均匀一致，酸甜爽口，具有典型的蛹虫草香味和芡实清香，易被大众接受，感官评分高达94分。其pH为4.5～4.8，细菌总数≤100 CFU/mL，大肠杆菌≤3 MPN/mL，未检出致病葡萄球菌，符合国家食品生产卫生标准。

表3 筛选蛹虫草芡实保健饮料最佳配方的正交试验方案及结果

2.2 蛹虫草芡实饮料对果蝇生殖力和寿命的影响

2.2.1 果蝇生殖力 由表4可知，不同浓度的蛹虫草芡实保健饮料对果蝇生殖力影响不同。与CK比，Ⅰ组(5%)、Ⅳ组(20%)和Ⅴ组(25%)的饮料饲喂果蝇，其F1和F2的成蛹数和成虫数变化均不明显；Ⅱ组(10%)子代的成蛹数和成虫数均显著增加，F1和F2较CK分别提高15.85%、15.14%和13.13%、12.52%；Ⅲ组(15%)子代的成蛹数和成虫数均极显著增加，F1和F2较CK分别提高21.22%、21.12%和19.54%、22.78%。表明，添加适宜浓度(10%、15%)的蛹虫草芡实饮料能提高果蝇的性活力，从而显著提高果蝇生殖力。

表4 不同饮料饲喂果蝇其子代的成蛹数和成虫数

2.2.2 果蝇寿命 以雌(♀)、雄(♂)果蝇半数死亡时间、平均寿命和最高寿命3个指标评价蛹虫草芡实饮料对果蝇寿命的影响。从图2看出，不同浓度的蛹虫草芡实保健饮料对果蝇寿命影响不同。Ⅴ组(25%)果蝇全部死亡。与CK比，Ⅰ组(5%)和Ⅳ组(20%)饮料饲喂雌(♀)、雄(♂)果蝇，其半数死亡时间、平均寿命和最高寿命差异不明显；Ⅱ组(10%)雌、雄果蝇的3个寿命指标较CK分别提高10.97%、7.82%、11.27%和10.84%、10.73%、13.31%；Ⅲ组(15%)较CK分别提高14.01%、13.11%、15.67%和16.91%、14.57%、16.88%。表明，蛹虫草与芡实具有良好的抗氧化活性，能够延缓衰老；适宜浓度(10%、15%)的蛹虫草芡实保健饮料能提高果蝇寿命。

图2 蛹虫草芡实饮料饲喂果蝇的寿命

3 讨论

蛹虫草和芡实均是集食用、药用和保徤功能于一体的养生佳品，具有较好的市场开发前景[23]。利用蛹虫草开发新型保健品多以蛹虫草浸提液或蛹虫草发酵液配制而成。南晓洁等[24]以蛹虫草和黄花菜为主要原料，复配枸杞子药食同源的物料，成功研发出一款复合饮料；雷燕妮等[25]采用蛹虫草和葛根为原材料，研发出一种具有提高免疫力、提高女性雌激素及预防心脑血管疾病等功效的新型固体饮料。芡实是能量和膳食纤维的理想来源，其含有较多的生物碱成分，长期食用有较好的“降火”功效，如今已被广泛应用于食品工业，如芡实香肠[26]和芡实饮料[17]。

以蛹虫草、芡实、蜂蜜、白砂糖和柠檬酸为原料制备的保健饮料，其颜色淡黄、清亮，酸甜爽口，具有典型的蛹虫草香味和芡实清香。通过单因素和正交试验进行工艺优化表明，蛹虫草浸提液和芡实滤液体积比为3∶7，蜂蜜、白砂糖和柠檬酸添加量分别为10%、8%和0.10%时其品质最佳。依据果蝇生殖力和寿命试验结果得出，适宜浓度(10%、15%)的蛹虫草芡实饮料有效提高果蝇寿命和性活力，从而提高其生殖力。前人主要集中研究通过正交试验筛选蛹虫草与复配物的最佳配比，仅局限于产品的口感、色泽和营养价值等方面。而蛹虫草芡实饮料的研究通过正交试验确定最佳配比，并以果蝇的生殖力和寿命作为检测标准，进一步验证该配比饮料对果蝇生殖力和寿命的影响，使配方更科学，功能更明确，效果更显著。

4 结论

蛹虫草浸提液和芡实滤液体积比为3∶7，蜂蜜、白砂糖和柠檬酸添加量分别为10%、8%和0.10%时，蛹虫草芡实保健饮料的颜色淡黄、清亮，酸甜爽口，具有典型的蛹虫草香味和芡实清香，其pH为4.5～4.8，细菌总数≤100 CFU/mL，大肠杆菌≤3 MPN/mL，符合国家食品生产卫生标准。CK(对照培养基)，F1和F2的成蛹数、成虫数分别为65.98只、59.13只和64.43只、57.02只。10%饮料饲喂果蝇，F1(76.44只、68.08只)和F2(72.89只、64.16只)的成蛹数、成虫数分别较CK提高15.85%、15.14%和13.13%、12.52%；15%饮料饲喂果蝇，F1(79.98只、71.62只)和F2(77.02只、70.01只)的成蛹数、成虫数分别较CK提高21.22%、21.12%和19.54%、22.78%。CK雌(♀)果蝇和雄(♂)果蝇半数死亡时间、平均寿命和最高寿命分别为55.13 d、60.43 d、74.26 d和55.81 d、60.32 d、78.56 d。10%饮料饲喂雌果蝇(61.18 d、65.16 d、82.63 d)和雄果蝇(61.86 d、66.79 d、89.02 d)，其半数死亡时间、平均寿命、最高寿命分别较CK提高10.97%、7.82%、11.27%和10.84%、10.73%、13.31%；15%饮料饲喂雌果蝇(62.85 d、68.35 d、85.90 d)和雄果蝇(65.25 d、69.11 d、91.82 d)，分别较CK提高14.01%、13.11%、15.67%和16.91%、14.57%、16.88%。表明，蛹虫草芡实保健饮料的最佳配方为蛹虫草浸提液和芡实滤液体积比3∶7，同时添加10%蜂蜜、8%白砂糖和0.10%柠檬酸；适宜浓度(10%、15%)的饮料饲喂果蝇能明显提高其生殖力和寿命。