油莎豆粕为原料生产纳豆激酶的工艺研究

姚启悦，赵永亮，李飞寰，任军华，赵春杰，安星亮，王欢

(河南工业大学 生物工程学院，郑州 450001)

油莎豆(Cyperusesculentus)又称虎坚果、油莎草，是莎草科莎草属的一年生草本油料作物，原产于非洲北部[1]，现广泛分布于非洲、欧洲、亚洲、北美洲和南美洲的热带、亚热带、温带地区[2]。油莎豆茎叶是优质牧草和编织原料，块茎生长于地下，形似花生，可直接食用，且含油量丰富，平均可达到20%～30%，其中不饱和脂肪酸占70%以上[3]，单位产量远高于其他油料作物，有“油料之王”的美称，油莎豆生命力强、根系发达、繁殖快、生物量大、抗逆性广，能够适应多种类型土壤，大规模利用边际化土壤种植可起到防止水土流失、改善生态环境的作用[4]，目前在我国十几个省广泛种植，种植面积在25万亩左右，一般亩产量为500～600 kg，主要分布在东北、西北、黄淮、长江流域等沙性土壤地区[5]。油莎豆基本成分中水分、蛋白质、脂肪、糖、淀粉平均含量分别为7.00%、8.00%、26.50%、23.32%、23.21%，检出有机酸、甾类化合物、萜类化合物等功能性成分[6]；研究表明油莎豆具有降血脂[7-8]、降血糖[9-10]、抗氧化[11-12]、保肝[13-14]、护胃[15]等生理功能。油莎豆作为新型油料作物，对未来减少大豆进口，提高食用油自给率，帮助改善环境与产业脱贫具有极大的发展前景与竞争力[16]。

纳豆(natto)是大豆等豆类经纳豆枯草芽孢杆菌发酵得到的具有特殊风味和黏性多糖的发酵豆制品[17]，1980年日本学者须见洋行发现纳豆能够溶解人工血栓，随后该团队从纳豆中提取出具有溶栓功能的激酶，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)[18]。NK是由275个氨基酸组成的单链多肽酶，是一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为27 kDa，等电点在8.6左右[19]。NK在体内外均表现出良好的溶栓效果[20]，现阶段能够溶解血栓的药物及物质非常多，常见的有尿激酶、链激酶等，相比于其他溶栓药物，NK具有成本低、生物安全性好、副作用小、易被人体吸收、半衰期长等优点[21]。NK除了能够溶解血栓外，还具有预防骨质疏松[22]、降血压[23]、降血脂[24]、减脂助消化[25]、免疫调节[26]等功能。随着人口老龄化的加剧，以心脑血管疾病为主的老年群体常见疾病备受关注，鲜食纳豆受销售环境和本身风味的影响推广受限[27]，NK类保健食品和溶栓药品的开发对老年群体的健康具有重大意义。

本研究以油莎豆粕为原料，以纳豆枯草芽孢杆菌为发酵剂，以纳豆激酶酶活为指标，通过优化发酵条件，获取更高的单位酶活，增强油莎豆粕的产业价值，为油莎豆资源的高效利用拓展了新途径。

1 材料与方法

1.1 菌种

纳豆枯草芽孢杆菌N500：河南工业大学分子生物实验室保藏。

1.2 原材料

油莎豆粕：购自河北省定州市。

1.3 试剂

尿激酶标准品(50 mg,50 000 U/g)：上海源叶生物科技有限公司；牛纤维蛋白原(1 g/瓶)、凝血酶(1 000 U)、琼脂：北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物：北京奥博星生物技术有限责任公司；NaCl、NaOH、HCl(均为分析纯)：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.4 培养基

斜面培养基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠1%，琼脂2%，121 ℃灭菌20 min。

种子培养基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠1%，调pH为7.0，121 ℃灭菌20 min。从4 ℃斜面保藏菌种中挑取1环接入10 mL种子培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养12 h后转接至50 mL种子培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养12 h。

发酵培养基：油莎豆粕9.65 g，加水20.35 mL，50 ℃水浴浸泡2 h，115 ℃灭菌30 min。发酵前，移取5%的种子液接入发酵培养基中，37 ℃培养48 h。

1.5 主要仪器与设备

LDZX-50KBS型立式压力灭菌锅 上海申安医疗器械厂；THZ-312型台式恒温振荡器、DK-8D型电热恒温水槽、SHP-150型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；Spark多功能酶标仪 帝肯(上海)贸易有限公司；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；FE22 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

2 试验方法

2.1 纳豆枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制

将活化的种子液按2%的接种量接种于液体LB培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养，每隔2 h取样，以无菌液体LB培养基作空白对照，测定A600 nm值，以时间为横坐标、A600 nm为纵坐标绘制生长曲线。

2.2 纳豆激酶酶活的测定

采用琼脂糖-纤维蛋白平板法[28-29]并稍作改进 测定酶活。配制浓度梯度分别为100，80，60，40，20，10 U/mL的尿激酶标准溶液，各取10 μL尿激酶溶液于打孔后的纤维蛋白平板上，设置3个平行，在37 ℃生化培养箱中恒温孵育18 h,用游标卡尺测量透明溶解圈的两条垂直直径，取其平均值计算其面积S=πd2/4，并绘制标准曲线。

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2.3 粗酶液的制备

豆粕培养基发酵结束后置于4 ℃冰箱中后熟12 h，按料液比(干纳豆∶生理盐水)为1∶5(g/mL)加入生理盐水快速振荡30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液，取10 μL粗酶液于打孔后的纤维蛋白平板上，设置3个平行，在37 ℃生化培养箱中恒温孵育18 h，用游标卡尺测量透明溶解圈的两条垂直直径，取其平均值计算面积，根据尿激酶标准曲线方程计算出粗酶液酶活。

2.4 单因素试验

2.4.1 油莎豆粕含水量对纳豆激酶活性的影响

油莎豆粕含水量影响发酵过程中菌体的生长和营养基质的溶解与传递，将其粗颗粒按照干重加入一定比例的蒸馏水,使其含水量分别为55%、60%、65%、70%、75%、80%，50 ℃水浴加热浸泡2 h，115 ℃高温高压灭菌30 min，接种量为5%，37 ℃恒温培养48 h，后熟时间12 h，设置3个平行，考察豆粕含水量对产酶的影响。

2.4.2 纳豆菌接种量对纳豆激酶活性的影响

接种量影响纳豆菌的发酵速度。豆粕含水量为70%，50 ℃水浴加热浸泡2 h，115 ℃高温高压灭菌30 min，分别接入2%、5%、8%、11%、14%、17%的种子液，37 ℃恒温培养48 h，后熟12 h，设置3个平行，考察接种量对产酶的影响。

2.4.3 发酵温度对纳豆激酶活性的影响

每种菌都有其最适的生长温度，其生长和发酵过程中的温度影响酶促反应速率。豆粕含水量为70%，50 ℃水浴加热浸泡2 h，115 ℃高温高压灭菌30 min，接种量为5%，发酵温度分别为28，31，34，37，40，43 ℃，发酵时间为48 h，后熟12 h，设置3个平行，考察温度对产酶的影响。

2.4.4 发酵周期对纳豆激酶活性的影响

发酵时间影响纳豆菌的生长周期和产酶代谢。豆粕含水量为70%，50 ℃水浴加热浸泡2 h，115 ℃高温高压灭菌30 min，接种量5%，发酵温度37 ℃，发酵时间分别为36，48，60，72，84，96 h，后熟12 h，设置3个平行，考察发酵周期对产酶的影响。

2.5 正交试验

根据单因素试验结果，选择含水量、接种量、发酵温度和发酵周期4个因素进行四因素三水平正交试验，进一步优化油莎豆粕发酵工艺。

2.6 数据统计分析

使用IBM SPSS Statistics 20分析软件分析数据的显著性，以P<0.05为显著性检验标准，数据使用Origin 2018软件绘图。

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3 结果与分析

3.1 纳豆枯草芽孢杆菌生长曲线

采用比浊法测定纳豆菌的生长曲线，结果见图1中a。纳豆枯草芽孢杆菌的生长基本符合微生物生长周期的4个阶段：0～2 h生长缓慢，处于调整期；2～8 h纳豆菌生长迅速，处于对数期；8～14 h为稳定期；14 h以后为缓慢衰亡期，应接种8 h处于对数生长期的纳豆菌。

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3.2 尿激酶标准曲线

采用琼脂糖-纤维蛋白平板法。以纤溶圈面积为横坐标、标准尿激酶活力的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，得到曲线方程y=0.006 8x+0.286，R2=0.998；二者呈线性相关，因此可通过将粗酶液在琼脂糖-纤维蛋白平板上的溶解圈面积代入回归方程而求得对应的尿激酶酶活。尿激酶标准曲线见图1中b。

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3.3 单因素试验

不同单因素对纳豆激酶活性的影响见图2。

当接种量为5%、发酵温度为37 ℃、发酵时间为48 h时，考察含水量对纳豆激酶酶活的影响，结果见图2中a。油莎豆粕含水量对发酵产酶的影响较大，当油莎豆粕含水量为70%时，发酵后纳豆激酶活性最高。含水量过少时，纳豆菌难以生长，产酶降低；豆粕含水量过高时，表面会形成一层白膜，影响发酵基质空气交换，纳豆菌供氧不足，生长缓慢，导致酶产量降低。因此，试验最佳豆粕含水量选取70%。

当含水量为70%、发酵温度为37 ℃、发酵时间为48 h时，考察接种量对纳豆激酶酶活的影响，结果见图2中b。随着菌液接种量的增大，纳豆激酶活性呈现先升高后降低的趋势，接种量过小时，菌体在豆粕培养基中无法充分生长，需要较长时间繁殖积累，无法发酵完全，从而延长发酵周期；接种量过大时，菌体繁殖旺盛，加速发酵培养基营养基质的消耗及有害代谢产物的积累，导致其次级代谢被抑制，产酶量降低。接种量为5%时，菌体生长速率适中，既能实现菌体的大量积累，次级代谢也可正常进行，酶活最高。因此，试验最佳菌液接种量选取5%。

当含水量为70%、接种量为5%、发酵时间为48 h时，考察发酵温度对纳豆激酶酶活的影响，结果见图2中c。随着发酵温度的升高，纳豆激酶的活性显现出先升高后降低的趋势，发酵温度为40 ℃时，纳豆激酶活性最高；当温度高于40 ℃时，酶活逐渐减弱。微生物都有其最适的生长温度，一定范围内，温度升高能提高菌体的生长速率、酶促反应速率及蛋白合成速率；温度过高时，生长及产酶能力均会下降，导致酶活降低。因此，试验最佳发酵温度选取40 ℃。

当含水量为70%、接种量为5%、发酵温度为37 ℃时，考察发酵周期对纳豆激酶酶活的影响，结果见图2中d。随着发酵时间的延长，纳豆激酶活性呈现先升高后缓慢降低的趋势，在发酵36～72 h过程中，纳豆激酶活性呈升高趋势；发酵时间为72 h时，酶活性最高；发酵时间超过72 h后，油莎豆粕培养基中的营养物质不足以支撑纳豆菌的正常代谢，同时次级代谢副产物逐渐增加，影响了纳豆激酶分泌，从而导致纳豆激酶酶活缓慢降低。因此，试验最佳发酵周期选取72 h。

3.4 正交试验

在单因素试验结果的基础上，选取A含水量、B接种量、C发酵温度和D发酵周期4个因素为变量，进行L9(34)正交试验,试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

由表2可知，各因素对纳豆激酶活性的影响程度大小为A>C>B>D，最佳纳豆激酶酶活的试验方案为A3B2C1D3,即油莎豆粕含水量是影响产酶的主要因素，其次是发酵温度，接种量和发酵周期对产酶的影响较小。

由表3可知，油莎豆粕含水量和发酵温度对纳豆激酶酶活的影响极显著(P<0.01)，接种量和发酵周期对纳豆激酶酶活的影响不显著。综合T检验和方差分析可知，正交试验优化后确定的最适发酵条件是豆粕含水量75%、接种量5%、发酵温度37 ℃、发酵周期84 h，所得纳豆激酶酶活为10 382.90 U/g。

表3 各因素对油莎豆粕培养基发酵产纳豆激酶活性的方差分析Table 3 Variance analysis of various factors on the activity of nattokinase produced from Cyperus esculentus meals media fermentation

4 结论与讨论

通过单因素和正交试验优化后，得出油莎豆粕发酵产纳豆激酶的最佳工艺条件是豆粕含水量75%、接种量5%、发酵温度37 ℃、发酵周期84 h。在此优化条件下，所得纳豆激酶平均酶活为10 382.90 U/g，氨臭味较轻。

刘野等[30]利用单因素试验和响应面分析，以黄豆为原料对纳豆发酵条件进行优化，得到纳豆激酶活性为2 493.33 U/g。张红运等[31]通过单因素试验和正交试验，以豆渣为原料优化固态发酵产纳豆激酶工艺，得到酶活为1 734 U/g。郭玩湘等[32]利用单因素试验和正交试验，优化以豆粕与麸皮为原料的纳豆激酶固态发酵工艺，最高酶活达到6 642 U/g。本试验优化得到的纳豆激酶活性最高达到10 382.90 U/g，明显高于以大豆及其豆粕为原料发酵得到的纳豆激酶酶活，单位酶活力提高了56.32%，为油莎豆粕的利用和纳豆激酶的产业化生产提供了参考途径。