依赖于豆粕原材料的纳豆激酶制备和纯化工艺研究

吴丹，杨苗苗，杜小平，祁蒙，杨水云

(1.陕西学前师范学院 生命科学与食品工程学院,西安 710100；2.安康市富硒产品研发中心，陕西 安康 725000；3.西安交通大学 生命科学与技术学院，西安 710049)

纳豆激酶(NK)是纳豆中最具开发价值的成分，该酶为枯草蛋白酶类第一个具有纤溶作用的酶，可以应用于临床的溶栓治疗过程中[1]。纳豆激酶是一种由纳豆芽孢杆菌发酵产生的碱性胞外丝氨酸蛋白酶，具有良好的溶栓作用[2]，可有效预防或治疗心脑血管疾病[3-4]。该酶与目前溶栓药物如尿激酶(urokinase，UK)和链激酶(streptokinase，SK)相比，具有pH广[5]、温度耐受性强及溶栓特异性等优点[6—7]。

Chandrasekaran等[8]发酵生产的NK可溶解94%的人工血栓；Janh等[9]研究表明NK在小鼠体内有一定的溶栓效果；Hsia等[10]和Yuko等[11]研究证实口服NK后，NK在体内有良好的溶栓效果。NK的优势在于其对纤维蛋白，尤其是对交联的纤维蛋白特别敏感，可直接作用于血栓中的纤维蛋白,将其溶解为小肽和氨基酸[12—13]。这一特性使得NK更偏好溶解血栓中的纤维蛋白而不易溶解血浆纤维蛋白原，因而不会破坏正常凝血机制而引发出血，且目前临床现用的溶栓剂无此特点，但目前NK产品纯度较低，因此，提高NK纯度意义重大。

工业上生产NK都是从纳豆杆菌的发酵液中提取纯化的。报道的NK纯化方案，常集多种手段联合使用。但在总结前人纯化结果后发现[14—19]，使用柱层析法，NK的酶活回收率普遍不高，不仅如此，柱层析法也具有成本高、方法繁琐、步骤较多、耗时且难以规模化生产的缺点[20]。超滤法可以有效地去除料液中相对分子质量较大和较小的组分，避免了盐析方法中高渗作用所造成的酶活性降低，但纯化倍数很低。利用亲和吸附法对NK纯化，例如用大豆颗粒对NK进行特异性吸附，吸附的配体结构不清楚[21]，操作较为复杂，不适合工业化生产。

在纳豆杆菌发酵豆类制作的纳豆表面，可以看见很长的拉丝状黏液。在纳豆杆菌发酵黄豆粉产生NK的液体发酵中，也总是伴随着大量黏液的产生，其产量远远大于NK，现已研究清楚，该黏液的主要成分为γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-pGA)[22—25]，分子量为100～1 000 kDa，等电点为2.5，属于典型的酸性高聚物，而NK的分子量仅为27.7 kDa，等电点为8.7。在pH 7.0～7.5的发酵液中，NK带正电而γ-pGA带负电，二者通过静电力以“偶联状态”结合，形成以大分子量的γ-pGA为载体的多分子纳豆激酶联合物，从而大大降低了NK的表观活性[26]。目前，基于以上工艺的NK产品无法实现微剂量服用目标，更不能满足注射针剂的要求，因此要获得高纯度的NK，需要将大量γ-pGA从粗产品中去除。

本研究在建立可行的液体发酵法生产NK工艺的基础上，提出了从发酵液纯化NK的下游方案，该方案大幅度提高了NK的纯度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和供试样品

纳豆芽孢杆菌N5：西安交通大学生命学院基础实验室分离纯化所得；供试样品为市售的脱脂豆粕及黄豆。

1.1.2 试剂及培养基

试剂：纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶和γ-聚谷氨酸，购自上海源叶生物科技有限公司；琼脂糖，购自Amresco公司；十六烷基三甲基溴化铵，购自Alfa Aesar公司；BCA蛋白定量试剂盒，购自碧云天生物技术。其余化学试剂均为国产分析纯。

LB培养基：用于菌种的活化及种子液的配制。1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。

天然发酵培养基：用于纳豆激酶的发酵。3%脱脂豆粕匀浆搅拌，用1 mol/L NaOH溶液调节培养基pH为7.4左右，121 ℃高压灭菌20 min。

1.1.3 主要仪器设备

THA-3560C立式灭菌锅 Tsao Hsin公司；酶标仪 Molecular Devices公司；BSA124S 电子天平 德国Sartorius公司；PYX-DHS-40X50电热恒温培养箱 广州沪瑞明仪器有限公司；LYZ-Z00B恒温摇床 上海龙跃仪器设备有限公司；Centrifuge 5810R离心机 Eppendorf公司；SW-CJ-1FD洁净工作台 苏净安泰公司；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 纳豆芽孢杆菌N5的培养及发酵方法

将纳豆芽孢杆菌N5接种于LB液体培养基中，在37 ℃条件下，在转速200 r/min的恒温摇床中振荡培养至对数期测定其吸光度，计算接种量。

3%的脱脂豆粕匀浆搅拌，用1 mol/L NaOH溶液调节培养基pH为7.4左右，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。冷却至室温后接种。纳豆芽孢杆菌种子液的接种量为0.05 OD/mL，恒温37 ℃，摇床转速200 r/min，发酵时间36 h。发酵完成后，发酵液于2 000 g条件下离心10 min，上清液为液体发酵的纳豆激酶溶液，利用纤维蛋白原平板法测定NK产量(Fu/g豆粕)。

1.2.2 纳豆激酶活力的测定

纳豆激酶的活力采用纤维蛋白原平板法[27]。根据样品的数量，用直径为2 mm的打孔器进行打孔。

1.2.3γ-聚谷氨酸的定量检测方法

在已有检测方法[28]的基础上进行如下改良：在350 nm的波长条件下，采用CTAB的NaOH溶液(10 g/L)检测γ-pGA。

1.2.4 纳豆激酶发酵培养基的优化

1.2.4.1 单因素条件优化

根据前期预实验结果，在确定发酵培养基中碳源为1%的甘油的基础上，以纳豆激酶的活力为指标，采用单因素实验研究豆粕、谷氨酸钠及无机盐含量对发酵结果的影响。发酵培养基的豆粕含量为1%、3%、5%、7%、9%；谷氨酸钠的质量浓度为0.5%、1%、1.5%、2%、3%；MgSO4·7H2O的质量浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%。以天然发酵培养基为对照。按0.05 OD/mL接种纳豆杆菌种子液，在37 ℃、200 r/min的条件下发酵36 h，测定纤溶圈直径，选取适宜的单因素条件。

1.2.4.2 多因素正交优化

在以上描述的各个单因素优化的基础上，根据正交表设计正交实验，优化最优碳氮源质量浓度、谷氨酸钠及硫酸镁含量等。测定并比较培养基优化前后的NK产量(Fu/mL)。

1.2.5 纳豆激酶与γ-聚谷氨酸解离及收集

在培养基中接种0.05 OD/mL的纳豆芽孢杆菌N5，37 ℃下200 r/min发酵36 h。用pH 10、10倍的Gly-NaOH缓冲液调节发酵液的pH至10，使得NK和γ-pGA均带负电，不再紧密结合。充分振荡混匀后，在2 000 g条件下离心10 min，收集上清液，沉淀用pH为10的Gly-NaOH缓冲液洗涤1次，2 000 g条件下再离心10 min，合并上清液待用。

1.2.6 不同pH值下NK产量的测定

发酵完成后，取原始发酵液1 mL，用pH为10的Gly-NaOH缓冲液调节pH至10，稀释至 2 mL，在涡旋仪上激烈振荡后，2 000 g条件下离心10 min后取上清液，采用纤维蛋白原平板法测定上清液的NK产量；以原始发酵液稀释1倍作对照。

1.2.7 十六烷基三甲基溴化铵沉淀γ-聚谷氨酸条件优化

将不同浓度的CTAB水溶液与“1.2.1”中得到的NK溶液等比例混合，用力摇匀后在1 000 g下离心10 min。收集含有NK的上清液，并分别测定上清液中残留的γ-pGA含量和NK的效价，得到去除γ-pGA的方案。

1.2.8 三相法浓缩提取纳豆激酶

采用三相法浓缩含有NK的上清液，具体参考张庆庆等[28-31]的方法进行。

1.2.9 纳豆激酶冻干粉效价测定

磁力搅拌条件下，在pH 8.7、0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液中，对三相法收集的中间NK相进行透析，每隔2 h换液，2～3次后，于4 ℃进行透析过夜。透析液置入培养皿中，厚度在1 cm左右，放入-80 ℃冰箱中预冻，取出后放入冷冻干燥机中干燥24 h，即为高纯NK冻干粉。取NK冻干品5 mg，溶于0.5 mL 0.05 mol/L的Gly-NaOH缓冲液中(pH 10)(NK的最适pH为9～10)，充分振荡混匀后，采用纤维蛋白原平板法测定对应产品的效价。

1.2.10 计算公式

NK回收率的计算方法：回收率(%)=(离心后单位体积酶活×离心后酶溶液体积)/(离心前单位体积酶活×离心前酶溶液体积)。

NK比活力的计算方法：比活力(Fu/mg)=总活力/总蛋白。

NK纯化倍数的计算方法：纯化倍数=离心后的比活力/离心前的比活力。

2 结果与分析

2.1 尿激酶标定的纳豆激酶酶活工作曲线

采用已知的不同效价标准尿激酶溶液，测定其在人工血栓平板上形成的纤溶圈直径，纤溶酶可以使乳白色的纤维蛋白原降解为无色透明的片段和小肽，从而形成透明圈。可根据图1中纤维蛋白原平板上透明纤溶圈的大小和图2中标准曲线来表征尿激酶的纤溶活性。由图2可知，在尿激酶酶活为200～1 000 U/mL的区间内R2=0.996 6，酶活和直径的平方值有很强的线性相关性。因此，可以利用此标准曲线标定NK的酶活。

图1 标准尿激酶纤溶圈

图2 尿激酶标准曲线

2.2 豆粕含量对纳豆激酶活力的影响

在天然培养基中，豆粕的含量决定了纳豆芽孢杆菌生长的营养条件。在5种豆粕粉浓度下，发酵36 h后于2 000 g条件下离心10 min，取上清液，利用纤维蛋白原平板法测定上清液NK产量，结果见图3。

图3 豆粕含量对NK产量的影响Fig.3 Effect of soybean meal content on NK yield

由图3可知，豆粕含量为1%时，NK产量为808 Fu/mL，豆粕含量为3%时，NK产量为1 009 Fu/mL，豆粕含量大于5%时，NK产量缓慢降低。可见当豆粕含量较低时，NK产量也低，原因是可供纳豆芽孢杆菌生长发酵的营养不足；当豆粕含量升高时，营养充足，NK产量缓慢降低，原因可能是豆粕浓度较大，导致溶氧量较低，不利于纳豆杆菌的生长及发酵。后续实验中选择的豆粕含量为3%。

2.3 谷氨酸钠含量对纳豆激酶活力的影响

研究报道发现添加谷氨酸钠可以提高NK的分泌[32]，本研究对谷氨酸钠含量进行了优化，结果见图4。

图4 谷氨酸钠含量对NK产量的影响

由图4可知，谷氨酸钠的添加可以提升NK的产量，当发酵培养基中谷氨酸钠从0.5%增加到2%时，NK的产量逐渐上升到1 309 Fu/mL；当谷氨酸钠含量超过2%时，NK的产量会降低，所以选择谷氨酸钠的最佳含量为2%。

在实验中我们还发现，随着谷氨酸钠含量的升高，发酵液会更黏稠，说明谷氨酸钠浓度越高，纳豆杆菌分泌的γ-pGA就越多，这是因为谷氨酸钠是γ-pGA分泌的前体物质[33]。由于γ-pGA和NK等电点的巨大差异，在发酵液中二者会结合在一起。NK一旦被γ-pGA结合，就变成束缚型的NK，使其表观活性下降，不利于其作用于大豆蛋白供给菌体以充足氮源。此时γ-pGA就相当于NK的“代偿陷阱”[34]，致使菌体以代偿方式不断合成NK，最终提高了NK的产量。基于以上分析，实验结果表现为NK的产量与γ-pGA的含量呈正相关。所以通过添加谷氨酸钠，可提升NK产量。但当谷氨酸钠添加过量时，溶液过于黏稠，导致发酵液溶氧降低，影响了纳豆杆菌的好氧生长，生长量下降，需要的氮源下降，因而NK产量也随之降低。

2.4 Mg2+含量对NK产量的影响

Mg2+在蛋白质包括NK的合成中起着非常重要的作用，因而实验对发酵体系中Mg2+的浓度进行了优化。Mg2+对NK产量的影响的实验结果见图5。

图5 MgSO4·7H2O含量对NK产量的影响

由图5可知，NK产量随着MgSO4·7H2O含量的升高出现先升高后下降的趋势，当MgSO4·7H2O含量为0.3%时，NK产量最高。

2.5 正交法优化天然培养基

根据以上单因素实验结果，研究通过多因素正交实验法优化天然培养基中甘油、谷氨酸钠和硫酸镁的含量，实验结果见表1。

表1 不同添加物正交实验结果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiment of different additives

由表1中R值可知，在目前设计的实验条件下，谷氨酸钠对NK产量的影响最大，因此我们需进一步优化谷氨酸钠的浓度。由k值可知，降低谷氨酸钠浓度更合理。

分析各k值可知，在本实验设计条件下，最适培养基添加物为甘油0.5%、谷氨酸钠1%、MgSO4·7H2O 0.5%。在此培养基条件下重复进行NK发酵和产量测定，结果见图6。

图6 培养基优化前后NK产量对比Fig.6 Comparison of NK yield before and after the optimization of medium

由图6可知，当培养基的组成为豆粕3%、甘油0.5%、谷氨酸钠1%、MgSO4·7H2O 0.5%时，NK产量为1 486.6 Fu/mL，比优化前提高了48%。在此培养基条件下重复进行NK发酵和产量测定，结果稳定，重复性良好。

2.6 不同pH下所获纳豆激酶的产量

原始发酵液(pH为7)和调节pH为10后的发酵液NK的效价测定结果见图7。

图7 pH对NK产量的影响

由图7可知，pH为7的条件下所获粗酶液中NK效价为1 526 Fu/g，调节发酵液pH为10，即大于NK的等电点时，所获NK效价为2 123 Fu/mL，提高了39%。pH为7的条件下获得的NK冻干粉效价为1.88×104Fu/g，调节pH为10后，所获NK冻干粉效价为2.55×104Fu/g，比碱法解离前提高了41%。

2.7 CTAB沉淀γ-聚谷氨酸

十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)在水溶液中以聚阴离子形式存在，CTAB的氮原子可与γ-pGA中的羧基氧原子配对形成不溶于水的γ-pGA-CTAB络合物，反应后溶液变浑浊[28]，离心沉淀可去除γ-pGA。优化CTAB的浓度，使γ-pGA的沉降量最大，且最大程度地保持NK活性稳定。CTAB浓度对γ-pGA含量的影响见图8，CTAB浓度对NK活性的影响见图9。

图8 CTAB浓度对残留γ-pGA含量的影响Fig.8 Effect of CTAB concentration on residual γ-pGA content

图9 CTAB浓度对NK活力的影响Fig.9 Effect of CTAB concentration on NK activity

对NK活性以及残留γ-pGA含量进行综合分析，逐渐提高CTAB浓度，上清液中γ-pGA的残留量变化不大，但是NK的纤溶活性逐步降低。结合实验结果及成本考虑，选择最佳沉降的CTAB浓度为0.2 mol/L。

2.8 三相法浓缩提取纳豆激酶效果

固定叔丁醇 ∶料液(体积比)为1∶1，且保证叔丁醇的高度大于0.5 cm，通过改变容器直径来改变相界面面积，可发现相面积越大，越有利于传质，因而提取率和回收率随之增大，当硫酸铵终饱和度为50%时，结果见图10。

图10 不同大小接触面积下的NK纯化效果Fig.10 Purification effect of NK under different contact areas

实验结果发现，叔丁醇相与水相的相界面越大，NK回收率越高，纯化倍数基本不变。这意味着当相界面面积不足时，夹层中NK分子达到饱和造成分子拥堆，难以将水相中的NK一次性全部提取到夹层。因此在实际应用中，可以通过增加提取次数来减少NK的损失。

三相法中，若只进行一次提取，水相中的蛋白质不能完全分布到中间相，水相中的大部分NK很有可能并不能完全分布到夹层。在首次吸取夹层后，对剩余水相再次进行提取，如此反复使水相中的NK基本全部被萃取完全。在硫酸铵终饱和度为50%、接触面积直径为7.1 cm时，对NK进行多次提取，实验结果见图11。

图11 不同提取次数下的NK纯化效果Fig.11 Purification effect of NK under different extraction times

实验结果发现，随着提取次数的增加，NK的活力回收率和纯化倍数逐渐增加，提取3次时，NK活力回收率为87%，纯化倍数为35.3，提取4次时，NK活力回收率为91%，纯化倍数为35.7，基本不再增加，说明提取4次可基本把水相中的NK提取到中间沉淀相。因此在利用三相法浓缩纯化NK时，选择提取4次。

实验结果表明，蛋白的回收率随着体系中料液与叔丁醇接触面积的增大而升高，在叔丁醇与料液的体积比为1的条件下，若可保证叔丁醇在上相中的高度不小于0.5 cm，则接触面积越大越好。在本实验的体系中，提取4次可基本把水相的NK提取完，若体系不同，还需对提取次数进行优化，理论上提取次数越多，NK提取越完全。

利用沉淀剂CTAB对粗酶液中的γ-pGA进行沉降，对沉降后的上清液采用三相法进行浓缩，回收效果好。NK活力回收率为91%，纯化倍数为35.7。

2.9 高纯纳豆激酶冻干粉的效价

通过沉淀法及三相夹心法获得的NK冻干粉，其效价高达(7.88±0.76)×105Fu/g，获得的高纯NK冻干粉形态见图12。

图12 高纯NK冻干粉形态Fig.12 Morphology of high-purity NK lyophilized powder

由图12中A可知，获得的高纯NK冻干粉蓬松细腻，呈乳白色。由图12中B可知，高纯NK品相好，满足商品要求。若作为口服制剂，可制备成微胶囊(2.5～7.6 mg装量)，大大减少消费者的口服剂量，还为注射针剂的进一步研发打下良好基础。

3 结论与讨论

实验结果说明，当pH为10时，NK与γ-pGA均带负电，相互排斥，解离结合，与γ-pGA偶联的NK会游离至上清液中，从而提高了NK效价或产量。高pH有利于NK从γ-pGA上解离，提高NK回收率。考虑到过高pH对NK酶活的影响，后续纯化工艺中采用pH为10的条件。

碱法解离后在2 000 g条件下离心去除大分子的γ-pGA，经冻干，检测初纯NK效价为2.55×104Fu/g，与现有产品相比，其效价属于中等偏上水平，可作为保健品原料，但还是无法满足微剂量服用的要求。若利用CTAB对粗酶液中剩余的γ-pGA进行沉淀，再对沉淀后的上清液采用三相法进行浓缩纯化，可大幅度提高纳豆激酶的效价，获得的高纯NK效价为(7.88±0.76)×105Fu/g，超过了目前所能了解到的所有产品的纯度，使浓缩型微量NK口服制剂的制备成为可能，也为注射针剂的研发打下良好基础。