细胞焦亡在狼疮性肾炎发病机制中的研究进展

王 晨 林 栩

系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE)是一种复杂自身免疫性疾病，累及全身多器官系统，有多种免疫细胞如T淋巴细胞和B淋巴细胞的参与，以多种抗体以及免疫复合物的形成、补体激活为特征。狼疮性肾炎 (lupus nephritis, LN)是SLE患者的常见并发症。临床上以免疫抑制剂合并糖皮质激素为主要治疗手段，虽然病死率及肾脏存活率有所改善，还是有10%～30%的狼疮性肾炎发展为肾衰竭，需要肾脏替代治疗[1,2]。因而早期诊断及规范化治疗对提高狼疮病人生活质量以及改善预后有及其重要的意义。随着学术界对细胞程序性死亡的深入了解，目前已有研究表明，细胞焦亡这种新型细胞死亡方式与狼疮性肾炎的疾病进展密切相关。本文就细胞焦亡参与狼疮性肾炎疾病发生、发展机制的研究进展及未来应用前景展开讨论。

一、细胞焦亡

焦亡属于细胞程序性死亡(progammed cell death,PCD)的一种，是混合坏死和凋亡特征的一种非典型细胞死亡方式，在促进人的生长发育以及维持内环境稳态方面具有重要意义[3]。在1992年，Zychlinsky等发现了福氏志贺菌感染的巨噬细胞发生了细胞死亡，该型细胞死亡有细胞凋亡的特征：染色质固缩及DNA片段化，当时认定这种细胞死亡方式为细胞凋亡；无独有偶，Hilbi前后在1997年及1998年，在观察福氏志贺菌诱导巨噬细胞凋亡的过程中发现了激活的含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1)表达，且证明该种死亡方式不依赖于caspase-3，而是依赖于caspase-1[4，5]；1999年，Hersh等通过敲除巨噬细胞caspase-1阻断巨噬细胞死亡，证明caspase-1可能是此种细胞死亡方式的关键蛋白[6]。此后Brennan在2000年通过沙门菌诱导巨噬细胞死亡实验中也同样发现了该死亡方式与caspase-1密切相关，明确提出该种细胞死亡方式不同于细胞凋亡，可以破坏细胞膜，不伴有凋亡相关caspase-3及PARP的活化，且有明显的DNA片段化[7]。2001年Cookson和Brennan等正式以细胞焦亡来命名这种死亡方式[8]。至此关于细胞焦亡的研究开始飞速发展。2015年Gasdermin D作为焦亡关键效应蛋白被报道，焦亡的下游作用机制逐步完善[9]。随着对细胞死亡方式的研究以及对相关机制的了解，2018年细胞死亡命名委员会(Nomenclature Committee on Cell Death,NCCD)定义细胞焦亡为依赖Gasdermin蛋白家族成员形成的质膜孔隙的一种细胞死亡方式，与炎性caspase的激活与否没有必然联系，至此学术界对于细胞焦亡的定义日趋完善[10]。

细胞焦亡、细胞凋亡及细胞坏死三者同属PCD，彼此之间在生化和形态学特征虽有相似也各有不同，简言之胞核固缩或断裂，胞膜完整，有凋亡小体形成，为凋亡(apoptosis)细胞形态特征；胞核固缩或断裂，胞质肿胀，胞膜不完整，且有炎性小体的形成，为焦亡(pyroptosis)细胞形态特征；胞核肿胀或溶解，胞质肿胀，胞膜不完整，且有坏死小体的形成，为坏死(necrosis)细胞形态特征。细胞凋亡是一种由基因调控由凋亡小体介导的非炎性细胞程序性死亡方式。细胞坏死和焦亡可引起强烈的细胞炎症，质膜的完整与否是区别细胞凋亡与细胞坏死和焦亡的标志，细胞坏死中细胞膜通道成孔是由混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导的，而细胞焦亡则依赖于Gasdermin蛋白家族的非选择性打孔特性[11，12]。根据不同细胞死亡过程中细胞膜通透性的变化，可以通过Yo-PRO-1和Eth D-2双染证实是否发生焦亡现象[13～16]。Yo-PRO-1是一种细胞膜封闭的阳离子，在凋亡早期细胞膜通透性轻微增加，此时Yo-PRO-1可以进入细胞与DNA结合形成绿色荧光，Eth D-2相对分子质量则较大不能通过焦亡的细胞膜孔进入，而在坏死细胞中可呈现阳性，且有不能与其他染料共存的特性，详见表1。

表1 细胞凋亡、焦亡及坏死的比较

二、细胞焦亡关键蛋白

焦亡主要发生机制为NOD样受体(NLRs)或Toll样受体(TLRs)通过识别胞内或胞外的刺激因子，从而促进炎性小体的组装，炎性小体(inflammasome)由3个主要部分构成，细胞质传感器NLR蛋白 (NOD-containing protein-like receptors)、衔接蛋白凋亡相关斑点蛋白ASC (apoptotic-associated speck-like protein containing CARD) 和炎性半胱天冬氨酸蛋白酶-1前体蛋白(pro-caspase-1)。ASC作为接头蛋白负责NLR蛋白及pro-caspase-1的连接。又根据炎性小体的组成受体不同，分为NLRP1炎性小体、NLRP3炎性小体、AIM2炎性小体、IPAF炎性小体。其中NLRP1炎性小体及IPAF炎性小体可以不依赖于接头蛋白ASC可以直接与pro-caspase-1连接[17]。炎性小体在细胞焦亡中起承上启下的关键作用，炎性小体是一类可以在胞内识别病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)信号的受体。通过识别上游刺激，募集并活化caspase-1，活性caspase-1切割下游关键蛋白GSDMD，形成有细胞毒性的GSDMD-N端，激活下游炎性细胞因子IL-1β、IL-18。最终导致细胞焦亡。活化的caspase切割 GSDMD-N端及GSDMD-C端之间的柔性连接蛋白从而解除C端的自身抑制效应，以此激活Gasdermin。Gasdermin蛋白作为一种打孔蛋白可以在细胞膜上形成功能性孔隙，导致细胞肿胀破裂，胞内炎性物质释放激活并放大炎性反应。以下就caspase家族及Gasdermin家族在细胞焦亡这一过程中的作用机制作简略阐述。

caspase家族首先是作为细胞凋亡的关键蛋白而被人们熟知，随着研究的不断深入，caspase家族的其他功能也被渐渐发掘。目前已知caspase家族有16个成员，序列及结构高度相似，主要以N端前域结构的不同而鉴别，通常以无活性的酶原形式存在。这其中以caspase-1研究历史最为久远，参与多种疾病的发生、发展。caspase-1最早是作为白细胞介素(IL)-1β转换酶(ICE)被发现，且与1993年发现的线虫凋亡相关的蛋白CED-3具有同源性。

目前认为细胞焦亡主要是由caspase-1/4/5/11介导的一种细胞程序性死亡。根据caspase的不同区分焦亡的经典与非经典途径。依赖于caspase-1的细胞死亡方式称为经典焦亡途径，在内源性或者外源性危险信号刺激下，炎性小体组装活化，炎性小体活化后将pro-caspase-1 激活为活化的 caspase-1，并介导促进白细胞介素 -1β 和 IL-18 等炎性细胞物质的成熟及释放，从而招募更多的炎性细胞一步放大炎性反应。依赖人源caspase-4/5和鼠源的caspase-11的细胞死亡方式称为非经典焦亡途径，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)不依赖与TLR4 可以直接通过与CARD域(caspase募集结构域)结合激活caspase-4/5/11[9,18,19]。活化后的 caspase-4/5/11同样可以通过切割下游GSDMD，使后者C端结构域与N端结构域分离，暴露N端结构域，解除GSDMD的自身抑制作用。2015年有研究者发现缝隙连接蛋白1(pannexin-1,Panx-1)及膜通道嘌呤能受体蛋白P2X7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7)在非经典途径中发挥不可或缺的作用[20]。也有研究发现caspase-3可以通过切割GSDME并引发焦亡。

Gasdermins家族是一类在细胞焦亡的下游通路发挥活性的具有打孔功能的蛋白家族。包括括Gasdermin-A(GSDMA)、Gasdermin-B(GSDMB)、Gasdermin-C(GSDMC)、Gasdermin-D(GSDMD)、Gasdermin-E(GSDME/DFNA5)和 Pejvakin(PJVK/DFNB59)。其中GSDMD及GSDME在细胞焦亡中发挥主要作用，GSDMD的N端具有细胞毒性，C端与N端在静息状态下结合抑制不发挥毒性作用。当caspase活化后，可激活GSDMD解除自身抑制。该N端结构域具有在膜上打孔的作用，可导致细胞膜孔洞形成，细胞不断膨胀直至破裂，细胞内容物 IL-1β和IL-18等释放，从而激活并放大炎性反应，引发细胞焦亡[21]。

三、细胞焦亡在LN的炎性进展中发挥重要作用

无菌性炎性反应是许多临床肾脏疾病的特征，SLE及LN中炎症机制的失调，可以促进LN的器官损害，已有研究表明细胞焦亡在SLE和LN疾病发展过程中起重要作用，细胞焦亡可能成为系统性红斑狼疮的一种重要发病机制[22]。研究证实，NLRP3炎症体的激活以及其介导下游caspase -1依赖的细胞因子IL-1β和IL-18的释放，导致Gasdermin D介导的致死性细胞焦亡[23]。在LN患者和狼疮易感小鼠的足细胞中NLRP3炎性小体及caspase-1的活性片段p20被激活，且抑制NLRP3的激活可以减少狼疮性肾炎IL-1β、caspase-1的表达、足细胞损伤和蛋白尿的产生[24]。

2011年Kahlenberg等在狼疮性肾炎活检组织中检测到NLRP3、caspase-1和血清IL-18表达的增加[25]。提示这一组织为炎性小体的激活及细胞焦亡的发生做准备。2013年该课题组又发现SLE患者中发现中性粒细胞胞外杀伤网格(neutrophil extracellular traps, NETs)增多，可激活巨噬细胞中的NLRP3小体，促进caspase-1的活化及IL-1β和IL-18的释放，诱导细胞焦亡的产生，IL-18能够再次诱发NETs，循环加重SLE的发展及器官损害[26]。2014年Kahlenberg等[27]通过进一步构建狼疮小鼠模型，发现缺乏炎性小体中枢caspase-1 的小鼠不表现出SLE和LN的症状。在LN中，Pim-1可以激活NLRP3炎性小体导致焦亡通路的进一步活化，而在沉默Pim-1基因的足细胞中NLRP3、caspase-1、p20及IL-1β的活性则明显降低，这同样提示了细胞焦亡通路激活在SLE及LN发病机制中的重要作用[28]。也有研究者提出在LN中不仅有焦亡通路活性的增强，焦亡细胞的清除障碍可能会导致狼疮患者长期暴露自身抗原从而破坏免疫耐受进一步推动SLE的发病[29，30]。但这一观点还需要更多临床研究数据证实。

四、展 望

细胞焦亡发现以来，研究者通过对细胞焦亡的定义、打破、再定义、再打破。随着对细胞焦亡的了解不断深入，作用机制也逐渐明朗。大量研究表明细胞焦亡在许多肿瘤免疫及心血管疾病发病机制中发挥了重要作用。学术界关于狼疮与焦亡的研究空间很大，其中抑制细胞焦亡的过度激活并加速焦亡细胞的清除有可能是一种有力的狼疮治疗措施。未来的研究可以针对caspase的激活机制及与 GSDMD的直接作用关系，实现精准用药，使导入体内的细胞焦亡关键蛋白caspase-1及GSDMD等抑制剂直接作用于狼疮关键靶点。