ncRNAs介导的MPP7上调与ccRCC的相关性研究

章俞昕 程辉 陈卫建 陈滨海

肾癌是肾脏的恶性肿瘤，以起源于肾实质泌尿小管上皮的肾细胞癌为主，其中约70%为肾透明细胞癌（ccRCC）［1］。由于其早期症状的隐匿性，多数患者最初诊断时已发生远处转移失去了手术机会，预后较差［2］。随着基因组学的发展，新靶点和信号通路的挖掘将为ccRCC 的预测、治疗和改善预后带来新选择。本文旨在分析棕榈酰化蛋白7（MPP7）在ccRCC 中的表达及其与临床病理特征的关系，判断其诊断价值并分析其对预后的独立预测价值，预测与分析MPP7 作用机制。

1 资料与方法

1.1 TCGA 数据下载、处理、分析 从TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载泛癌项目数据并进行标准化处理。使用R 包limma、ggplot2 对MPP7 进行差异表达分析和可视化处理。

1.2 GEPIA 数据库分析 基因表达谱交互分析（GEPIA）用于分析MPP7 mRNA 和相关lncRNA 的差异表达，确定不同类型的癌症中MPP7 和相关lncRNA 的表达，进行生存分析，评估候选lncRNA 在ccRCC 中的预后价值。此外，还使用GEPIA 评估了MPP7 与ccRCC中免疫检查点的表达相关性。

1.3 starBase 数据库预测和分析 MPP7 的上游结合miRNA 由starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）预测。仅采用出现在≥3 个程序中的预测miRNA 用于后续分析。这些预测的miRNA 被认为是MPP7 的候选miRNA。通过starBase 对ccRCC 中的miRNA-MPP7、lncRNAMPP7 和lncRNA-miRNA 进行表达相关分析，并预测可能与关键miRNA 结合的候选lncRNA。

1.4 OncomiR 数据库分 析 OncomiR（http：//www.oncomir.org/）是一个探索miRNAs 相关研究的数据库。使用OncomiR 评估候选miRNA 的预后价值。

1.5 统计学分析 使用R3.6.3 软件进行统计分析，通过多重假设检验（Dunn’s test）评估各临床分期的MPP7表达差异。使用R 包pROC 进行ROC 分析。使用R 包Survival 进行单、多因素回归分析。

2 结果

2.1 MPP7 表达的泛癌分析 为了探讨MPP7 在肿瘤发生中的可能作用，首先分析MPP7 在18 种肿瘤中的表达情况。如图1A 所示，与正常标本相比，在13 种肿瘤中MPP7 均明显下调（P＜0.05），3 种肿瘤中明显上调（P＜0.05），在ESCA、LUAD 中无明显差异（P＞0.05）。接下来，利用GEPIA 数据库进一步验证了MPP7 在泛癌中的表达。如图1（B-N），MPP7 在7 种肿瘤中表达下调（P＜0.05），在6 种肿瘤中上调（P＜0.05）。综上所述，MPP7 可能在9 种癌症的癌变过程中起着重要的调节作用。

图1 MPP7在泛癌中的表达分析（*P＜0.05，**P＜0.01,***P＜0.001）

2.2 MPP7 在癌症中的预后价值 进行MPP7 在肿瘤中的生存分析（见图2），包括总生存率（OS）和无病生存率（RFS）。关于OS，MPP7 高表达在KIRC、KIRP中对预后有利，而在BLCA、LIHC 中影响预后。关于RFS，只有在ccRCC 中，MPP7 高表达提示预后良好。结合以上，高表达的MPP7 可作为ccRCC 患者较良好预后的生物标志物。

图2 基于GEPIA数据库对多种癌症与MPP7的预后分析

2.3 MPP7 的表达与ccRCC 的临床分期相关性分析 分析发现MPP7 的表达量在各临床分期对比正常组织均有下调。进一步分析各临床分期之间MPP7 的表达量差异（图3），T3/T4 分级组患者的MPP7 表达量低于T1/T2 分级组，高组织学期和高病理学分期患者的MPP7表达量低于低分期患者，远处转移阳性患者MPP7表达低于阴性患者。

图3 ccRCC中MPP7表达与临床特征的关系。A.组织学分级；B.M分期；C.病理分期；D.T分期；E.ccRCC队列MPP7表达的ROC曲线

2.4 MPP7 表达对ccRCC 的诊断价值 通过ROC 曲线评估MPP7 表达的诊断价值（图3E），MPP7 的曲线下面积（AUC）为0.974（95%CI：0.954-0.994），具有良好的诊断价值。

2.5 MPP7 高表达是ccRCC 预后良好的独立预后因素 单因素分析显示，肿瘤状态（HR=3.228，P＜0.001）、远处转移（HR=4.389，P＜0.001）、淋巴结状态（HR=3.453，P＜0.001）、病理分期（HR=3.946，P＜0.001）、年龄（HR=1.765，P＜0.001）、组织学分期（HR=2.702，P＜0.001）、MPP7 表达（HR=0.367，P＜0.001）与总生存率显著相关。多因素分析提示，远处转移阴性、年龄小、MPP7 表达上调是ccRCC 预后良好的独立预后因素。

2.6 MPP7 上游miRNA 的预测与分析 ncRNAs 在基因表达调控中起着重要的作用。为了确定MPP7 是否被一些ncRNA 所调控，利用Starbase 数据库预测了43 个可能与MPP7 结合的上游miRNAs，并利用Cytoscape3.9.0软件建立了miRNA-MPP7 调控网络。根据miRNA 在调控靶基因表达中的作用机制，miRNA 与MPP7 之间可能存在负相关性。进行表达相关分析显示MPP7 与包括hsa-miR-130a-3p 在内的20 个miRNA 呈显著负相关，与包括hsa-miR-532-5p 在内的6 个miRNA 呈显著正相关，与其他17 个预测的miRNAs 之间差异无统计学意义（P＞0.05）。最后，通过OncomiR 预测与MPP7 呈负相关的miRNA 在ccRCC 中的预后价值。最终发现包括hsa-miR-130a-3p 在内的8 个miRNA，其上调与患者预后呈负相关，可能是MPP7 在ccRCC 中最有潜力的调控miRNA。

2.7 关键miRNA 上游lncRNA 的预测和分析 利用starBase 数据库对hsa-miR-130a-3p 等8 个miRNA的上游lncRNA 进行了预测，共得到了347 个可能的lncRNAs，并构建了调控网络。通过GEPIA 网站检测这些lncRNAs 在ccRCC 中的表达水平。在所有的347 个lncRNAs 中，只有HAGLR 等7 个lncRNAs 与正常对照组相比有明显下调。在此基础上，对这7 个lncRNAs 在ccRCC 中的预后价值进行了评估。只有HAGLR、FGD5-AS1 表达较高的ccRCC 患者OS、RFS 均较好。根据竞争性内源性RNA 假说，lncRNA 可以通过与共享miRNA的竞争结合来增加mRNA 的表达［3］。因此，lncRNA与miRNA 之间应存在负相关或与mRNA 之间存在正相关。结合表达分析、生存分析和相关性分析，HAGLR和FGD5-AS1 可能是ccRCC 中hsa-miR-19b-3p/MPP7轴最有潜力的两个上游lncRNA。

3 讨论

本研究中，作者首先对MPP7 在泛癌中的表达进行分析，随后进行了生存分析，结果显示高表达MPP7 的ccRCC 患者预后较好。进一步研究发现MPP7 的表达量在ccRCC 不同临床分期中对比正常组织均有下调，除此之外较晚分期中的表达量对比较早分期也有下调。多因素分析显示MPP7 表达上调是ccRCC 预后良好的独立预后因素，提示MPP7 可能是一种潜在的抑癌基因。

有研究显示ncRNAs 通过ceRNA 机制参与了基因表达的调控。由此作者预测了MPP7 的上游调控miRNA，共得到了43 个miRNA。其中与MPP7 呈负相关性的miRNA 通常发挥着促进肿瘤发生的作用，例如hsa-miR-130a-3p 被认为是乳腺癌进展过程中关键的调控分子［5］；hsa-miR-130b-3p 能抑制前列腺癌的抑癌基因而参与其发病［6］；miR-454-3p 靶向TRIM3，抑制其表达以促进宫颈癌的进展［7］；hsa-miR-27a-3p 通过对PROS1mRNA 表达的抑制，对抗其发挥的抑制胆管细胞癌的作用［8］；hsa-miR-223-3p 在ccRCC 中表达上调，参与ccRCC 的启动和发展等［9-10］。经过表达和预后分析，筛选出包括hsa-miR-130a-3p 在内的8 个miRNA，其可能是MPP7 在ccRCC 中最有潜力的调控miRNA。

根据竞争性内源性RNA 假说，miRNA/MPP7 轴的潜在lncRNAs 可能是在ccRCC 中调控MPP7 表达的重要lncRNA［11］。作者利用starBase 数据库预测得到了347 个lncRNA，同样通过表达和生存预后相关分析，确定了两种最有潜力的上调型lncRNA，包括HAGLR和FGD5-AS1。有报道这两种基因在包括ccRCC 在内的一些恶性肿瘤中起抑癌基因的作用，例如HAGLR 能通过靶向miR-26b-5p抑制卵巢癌细胞增殖和促进细胞凋亡［12］，或通过表观基因沉默E2F1 来抑制肺腺癌生长［13］；FGD5-AS1 高表达的ccRCC 的生存期高于低表达组，也有小样本研究证实FGD5-AS1 能抑制胃癌上皮向间充质转化以抑制肿瘤生长［14］。

总之，MPP7 在包括ccRCC 在内的多种肿瘤中低表达，且MPP7 表达增加与ccRCC 预后良好有关，作为一种抑癌基因可以成为ccRCC 的独立预后标志物。其次，作者确定了MPP7 在ccRCC 中的上游调控机制，即HAGLR/FGD5-AS1-hsa-miR-19b-3p 轴。但本研究仍有局限性，需要大量临床实践加以验证。