结直肠癌中MMR蛋白表达意义的验证与研究

陈国群 嵇学仙 沈苗 毛建英 李斐

结直肠癌的发病率和病死率已排在全球恶性肿瘤的前3 位，并逐年增高［1］。随着基因分子生物学的深入研究，发现由错配修复（MMR）蛋白功能缺陷引起的微卫星不稳定性（MSI）与结直肠癌的发生和发展机制相关［2］。近年来，由MSI 引起了较多临床工作者的关注。由MMR 蛋白功能缺陷引起的高度MSI（MSI-H）在结直肠癌的指导治疗中作用明显，对其预后的评估也有重要意义［3-4］。经相关文献检测，所有结直肠癌病例中，有3%～5%的病例与遗传性结直肠癌综合征相关，其中以Lynch 综合征最为常见［5］，Lynch 综合征是一种遗传性家族性疾病，大部分患者会发生结直肠癌，患者及其家族中MMR 基因突变携带者，均有发生肠外多组织癌变的倾向。定期结肠镜检查，对于Lynch 综合征的家族遗传倾向患者，可以早期诊断肿瘤并及时进行干预治疗［6］。本研究旨在分析MMR 蛋白免疫组化（IHC）检测与MSI 分子检测的一致性，以及与临床多方面的相关性，并作为Lynch 综合征的一种常规筛查手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019 年3 月至2022 年6 月本院病理科结直肠癌根治术后经病理学确诊，肿瘤为原发性且术前未经新辅助治疗的232 例患者，其中男133 例，女99 例；年龄42～85 岁，平均年龄65 岁。

1.2 方法 对结直肠癌肿块标本进行MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2）IHC 检测，缺失表达者进行分子检测。本研究经由本院伦理委员会及技术委员会审核通过（2020.10）。（1）IHC：结直肠癌根治及活检标本离体后，先经10%甲醛液固定≥6 h，后脱水机梯度酒精脱水，石蜡包埋，进行连续切片（切片厚3～4μm），行常规HE 及IHC EnVision 法染色。一抗采用兔抗人单克隆抗体PMS2、MSH6，鼠抗人单克隆抗体MLH1 和MSH2，抗体向北京中杉金桥生物技术有限公司购买，按产品说明步骤进行染色。最后由本科两名主任医师进行IHC 切片的复读。IHC 判读标准：观察正常肠腺上皮细胞及周围淋巴细胞等内对照细胞，以细胞核棕黄/黄色为正常着色的前提下，肿瘤细胞阳性表达（+）为核着棕黄/黄色，阴性表达（-）为肿瘤细胞核未着色；MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 均呈阳性为MMR 正常蛋白表达（PMMR，图1-2），任意一种蛋白表达缺失则判读为MMR 蛋白缺失（DMMR）［7］（图3-4）。（2）分子检测：MSI 检测由迪安公司（杭州）采用MSI检测试剂盒进行，采用荧光PCR 扩增结合毛细管电泳法，检测NR-21、NR24、BAT-25、BAT-26、MONO-27 五个位点。具体方法：由科内2 名病理诊断主治医师经光镜下观察常规HE 切片选取样本，肿瘤样本为肿瘤成分≥20%的肿瘤石蜡包埋组织和对照样本为石蜡包埋癌旁正常组织；样本经DNA 提取、PCR 扩增、毛细管电泳分离后，分析判定微卫星检测结果。结果判定根据不稳定单核苷酸重复位点个数，由两名分子病理医师进行判读，≥2 个位点判断为MSI-H，≤1 个位点判断为微卫星低度不稳定或微卫星稳定（MSI-L/MSS）。

图1 肠癌（MSH2×100）

图2 肠癌（MSH6×100）

图3 肠癌（MLH1×100）

图4 肠癌（PMS2×100）

1.3 统计分析 采用SPSS19.0 统计软件。计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR 蛋白及MSI 表达情况 MMR 蛋白表达情况：232 例结直肠癌病例中，＞99%的病例MMR 表达良好（细胞核均匀染色），个别病例细胞核弱染色，但均有内对照（淋巴细胞等间质细胞着色）。MMR 总缺失例数为12 例，表达缺失率为5.17%，具体情况如下：MLH1（12 例，5.17%）、MSH2（0 例）、MSH6（0 例）、PMS2（12 例，5.17%），MLH1 和PMS2 均为共同表达。文献报道4.3%～20.0%的结直肠癌为DMMR［8-13］，冰岛的一项长达九年对1,182 例结直肠癌标本进行MMRIHC 筛查，发现DMMR 者共132 例，占肠癌的11.2%［14］；来自亚洲人群的一项日本人研究显示1,234例结直肠癌病例中，有61 例（4.9%）DMMR 患者［15］。鉴于人种、地域、饮食、气候的差异，理论上我们应该与日本的研究数据相符，实际上也的确如此。DMMR 病例进行MSI 分子检测均提示MSI-H，符合率100%。文献报道DMMR与高度MSI 一致率＞90%［16-17］，与文献报道相符。

2.2 DMMR 病例的临床资料与分析 单因素分析，DMMR 病例与结直肠癌患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度以及UICC 分期具有明显相关性，见表1。

表1 232例结直肠癌患者MMR表达与临床病理的关系（n）

2.3 DMMR 病例的临床追踪 结合阿姆斯特丹Ⅱ标准、修订版的贝塞斯达标准，12 例DMMR 患者中，有1 例高度怀疑为林奇综合征病例，但因经济等多方面原因，患者未做林奇综合征的基因检测。随访过程中，该例患者复查肠镜，提示左半结肠癌，其兄妹及母亲行肠镜检查，也均检及管状腺瘤。故可将该患者列为“林奇综合征样”病例，对其家族进行随访。余11 例DMMR患者中，有4 例患者在术后两年随访中，肠镜检出管状腺瘤，3 例CT 检出肺部磨玻璃结节，1 例子宫肌瘤，1例前列腺癌。

3 讨论

微卫星作为一种在复制过程中长度一般保持不变的具有端重复单元的DNA，容易在复制过程中出现错配。MSI 的发生即DNA 复制过程中产生错配DNA，MMR蛋白无法对其准确识别并修复［18-19］进而导致的结果。DMMR 更常见于低分化癌、肿瘤体积较大以及UICC 分期Ⅰ～Ⅱ期患者。目前，临床诊疗中发现，检测肿瘤MSI 对结直肠癌的诊疗和判断预后有重要意义，大部分学者认为，MSI-H 提示结直肠癌患者预后良好［20］。另外，大多数研究结果显示，结直肠癌患者MSI 可作为5-FU 辅助治疗无效的预测标志物［21］。

林奇综合征是一种由于DNA MMR 基因发生胚系突变所致的常染色体显性遗传病。突变基因携带者本人及家族成员最常多发结直肠癌，在所有结直肠癌的所占比例约3%～5%，还会发生肠外其他多种相关肿瘤，包括女性发生子宫内膜癌、卵巢癌，泌尿系肿瘤如膀胱癌、肾癌，消化道肿瘤如胃癌、小肠癌等。携带者有较高风险终生患结直肠癌和子宫内膜癌，而且普遍在年纪较轻时发病，平均诊断年龄分别约为45 岁和46 岁，而普通人群多为中老年发病。早期发现诊断林奇综合征可以通过及时治疗降低结直肠癌患者死亡率并预防结直肠癌的发生，降低其发病率。

因此有效的筛查手段至关重要，参考美国国立综合癌症网络（NCCN）推荐使用MSI 或IHC 对所有结直肠癌患者进行林奇综合征筛查。综合考虑操作简便、价格实惠等因素，病理科会选用IHC 法检测MMR 蛋白，筛查肿瘤MSI 状态。经验证，本研究DMMR 与高度MSI一致率达到100%。故MMR 蛋白IHC 检测可作为MSI分子检测的完美替代品，可以减轻患者的经济负担，并结合临床资料以及结合阿姆斯特丹Ⅱ标准、修订版的贝塞斯达标准，可作为林奇综合征的筛查手段。

最新研究显示：已被用于多种恶性肿瘤治疗的程序性细胞死亡受体1（PD-1）抗体，对普通人群结直肠癌患者治疗效果不明显，因结直肠癌被视为免疫“冷”肿瘤，故而对抗PD-1 治疗不敏感。DMMR/MSI-H 的分子特征是筛选免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗患者的重要分子标志物［22］。PD-1 免疫检查点药物对MSI-H 的CRC 表现出高缓解率，并且在其他MSI-H 晚期肿瘤也对PD-1 治疗有较好的疗效，包括子宫内膜癌、胃癌、胆管癌和小肠癌。2017 年NCCN 临床实践指南更新，推荐PD-1 免疫检查点药物用于具有MSI-H 或dMMR 分子表型的mCRC 的治疗。因此MSI 可以作为PD-1 免疫检查点药物有效性的生物标志物。