鼻咽拭子中鼻病毒三种检测方法比较分析

郝丹凤 陈坚 张梓祺 董学妍 林源吉 余道军

鼻病毒（Human Rhinovirus，HRV）属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是一组单正链的小分子RNA 病毒。HRV 的主要传染源是患者及病毒携带者，经过呼吸道传播，可通过手到鼻或飞沫直接传播。主要发生在早春和气温突然下降时节，尤其在人群拥挤及空气不流通的地方易传播［1-2］。在呼吸道疾病中HRV 感染可以和其他病毒、细菌一起引发双重感染、多重感染或者混合感染［3-4］。HRV 的实验室检测方法与其他呼吸道病毒类似，包括病毒的分离培养与鉴定、核酸测序法、免疫学检测以及基于PCR 技术的病毒核酸检测［5-6］。随着对HRV 致病性认识的加深和实验室检测技术的发展，基于荧光定量PCR 技术的HRV 分子诊断试剂的研发受到重视。本研究选取鼻咽拭子标本作为观察对象，分别采用病毒分离培养、核酸测序以及荧光定量PCR 方法检测HRV，对比分析三种方法的检测性能，为基于荧光定量PCR 方法检测HRV 分子诊断试剂研发提供临床验证数据。

1 资料与方法

1.1 实验器材 HRV 核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法，中山大学达安基因股份有限公司生产，生产批号：ZC2021003）；检测设备：实时荧光定量PCR 仪（型号：7500；注册证号：国械注进20163220767）；核酸提取试剂：核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20170583 号；批号：2021059）；Hela 细胞（ATCC CCL-2），EMEM 培养基（ATCC 30-2002），胎牛血清（Gibco 10099141C）；测序法所用仪器为ABI 3730 测序仪（Thermo Fisher ABI 3730XL）。

1.2 一般资料（1）入选依据：本次临床试验主要选取临床确诊或疑似为HRV 感染的病例，如呼吸道感染，包括肺炎、支气管炎等患者（表现为发热、流涕及鼻塞、咳嗽、喘息、气促等局部呼吸道症状）。同时，为考查HRV 核酸检测试剂盒的临床特异性，本次临床试验还将纳入部分临床症状与HRV 感染相似，且临床诊断为其它细菌或病毒感染（如呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、人类冠状病毒229E 型、人类冠状病毒OC43 型、人类冠状病毒NL63 型、人类冠状病毒HKU1 型、肺炎衣原体、肺炎支原体、SARS 病毒、肠道病毒等）的病例。（2）入选标准：①临床疑似为HRV感染的病例，如呼吸道感染病例，包括肺炎、支气管炎等；②临床症状与HRV 感染相似，且临床诊断为其它细菌或病毒感染的病例；③取样后封装保存的鼻咽拭子或≥1mL 的样本保存液；④性别、年龄不限。（3）排除标准：①样本量不足以检测者；②不符合入选标准者。（4）剔除标准：①登记表记录核心信息不完整的病例；②样本因收集或保存不当不能用于检测者或检测失败者。

1.3 标本采集方法 本次临床试验中所使用的样本均为人鼻咽拭子样本。样本采集方法为使用棉拭子轻柔转动、缓慢插入受试者鼻孔至颚部，停留片刻后缓慢转动退出，将鼻咽拭子置入无菌采样管，共采集2 根拭子。核酸提取前，加灭菌生理盐水1.5 mL 至无菌采样管，1根拭子放入生理盐水管用于荧光探针法，充分震荡摇匀，挤干棉拭子，立即离心或置4℃冰箱过夜；另1 根拭子放入病毒保存管中（内含3 mL 病毒保存液），用于病毒分离培养。所采集的标本可立即用于测试，或长期保存于（-70±5）℃，也可以保存于（-20±5）℃待测，保存期为6 个月，标本避免反复冻融。以上鼻咽拭子样本采集已获得伦理委员会批准豁免签订受试者知情同意书。

1.4 试验方法（1）PCR-荧光探针法（荧光定量PCR 法）：编盲样本按照说明书及样本操作规程进行预处理即核酸提取，可马上进行下一步实验，或保存于（-20±5）℃待用（7 d 内使用）。提取后的样本按照HRV 核酸检测试剂盒说明书进行检测，若检测结果不符合质量控制标准，则按说明书要求进行复检，若复检仍不符合质量控制标准，则剔除该样本；若结果符合质量控制标准，则认为结果可信。（2）病毒分离培养鉴定：按照病毒分离培养鉴定操作规程进行病毒分离培养。若检测结果不符合质量控制标准，则进行复检，若复检仍不符合质量控制标准，则剔除该样本；若结果符合质量控制标准，则认为结果可信。（3）测序法：按照病毒核酸测序法（Sanger 测序方法）进行操作。若检测结果不符合质量控制标准，则进行复检，若复检仍不符合质量控制标准，则剔除该样本；若结果符合质量控制标准，则认为结果可信。

1.5 统计学方法 试验结果统计分析选用符合方案数据，即所有符合试验方案要求的受试者样本数据进行统计分析，主要采用四格表整理试验数据。考核试剂和核酸测序法对比采用Kappa 一致性检验，P≤0.01 为差异有统计学意义。试验真实性评价：阳性符合率、阴性符合率、总符合率、Kappa 值等指标计算。

2 结果

2.1 样本入组情况 本次试验共随机筛选鼻咽拭子样本220 例，根据排除标准和剔除标准，最终入组样本220 例，均为新鲜样本。样本年龄范围为7 d～87 岁（见表1），其中男103 例（占比46.82%），女117 例（占比53.18%）。本研究主要依据临床背景信息选取疑似为HRV 感染的病例，同时还纳入了少量易混淆的其它病原体感染病例对PCR-荧光探针法的检测性能进行验证。上述入组样本的临床背景信息主要包括：发热130例，肺炎13 例，喘息性支气管肺炎6 例，支气管肺炎23 例，吸入性肺炎1 例，肺部感染4 例，支气管炎7例，急性毛细支气管炎4 例，急性支气管炎2 例，哮喘性支气管炎3 例，呼吸道感染2 例，急性上呼吸道感染11 例，急性扁桃体炎6 例，急性化脓性扁桃体炎3 例，急性喉气管炎2 例，支气管扩张伴感染1 例，支气管哮喘1 例，咳嗽1 例及其它相关症状，部分样本存在多病症交叉情况。

表1 年龄占比分层图

2.2 三种方法HRV 检出率 本次试验共检测鼻咽拭子样本220 例，病毒分离培养检测阳性样本为20 例、阴性样本为200 例；核酸测序法检测阳性样本为32 例、阴性样本为188 例；PCR-荧光探针法试剂检测结果为阳性的样本为35 例、阴性样本为185 例。

2.3 PCR-荧光探针法与病毒分离培养鉴定结果分析 根据病毒分离培养检测结果，将220 例鼻咽拭子样本研究对象分为阳性组和阴性组，将PCR-荧光探针法检测结果与其进行比较评价（见表2），两者检测阴阳性结果不一致样本15 例。使用SPSS22.0 软件进行kappa检 验，kappa=0.692（95%CI：0.549～0.835），P＜0.001。α=0.05 检验水准下，PCR-荧光探针法与病毒分离培养检测结果的一致性一般。

表2 检测结果统计四格表（n）

2.4 PCR-荧光探针法与测序结果分析 根据核酸测序法检测结果，将220 例鼻咽拭子样本研究对象分为阳性组和阴性组，将PCR-荧光探针法检测结果与其进行比较评价（见表3），两者检测阴阳性结果不一致样本3例。使用SPSS22.0 软件进行kappa 检验，kappa=0.947（95%CI 0.888～1.006），P＜0.001。α=0.05 检验水准下，PCR-荧光探针法与核酸测序法检测结果的一致性好。

表3 检测结果统计四格表（n）

3 讨论

随着临床上对HRV 致病性、传染性及流行病学研究的深入，HRV 实验室检测也随之得到重视。本次临床试验采用病毒分离培养鉴定方法作为第一种实验室检测方法，采用测序法作为第二种HRV 核酸检测方法，将PCR-荧光探针法检测结果分别与两种方法检测结果进行比较分析，用以评价PCR-荧光探针法的临床应用性能。

本次临床试验随机筛选样本220 例，样本类型均为鼻咽拭子，均为新鲜样本。其中病毒分离培养和PCR-荧光探针法阴阳性检测结果不一致的样本15 例，核酸测序法2 和PCR-荧光探针法阴阳性检测结果不一致的样本为3 例，PCR-荧光探针法与核酸测序法2 检测结果一致性较好（kappa=0.947，P＜0.001）。

在PCR 法用于病毒检测前，病毒分离培养是作为病毒检测的金标准，病毒的分离与鉴定对监测流行病的新动向、研究新疾病、新病毒以及疫苗的研发都有重要作用。病毒分离法是一种传统的检测技术，其优点是可靠，缺点是操作繁琐，部分标本中病毒量少或活性低，产生细胞病变慢，常需盲传2～3 代，若作病毒型别鉴定，实验周期更长，现已较少用于临床［7］。对病毒分离培养和PCR-荧光探针法15 例检测结果不一致的样本进行分析，可能是样本HRV 载量较低，未达到能使细胞出现CPE 病变的最低浓度，而PCR-荧光探针法的检测灵敏度较病毒分离培养鉴定方法灵敏度高，从而导致PCR-荧光探针法检测结果阳性而病毒分离培养检测结果阴性。

Sanger 测序法采用的是直接测序法，是一代测序法的经典代表，发展较为成熟，测序片断较长，成本较低，但是只能测序，无法准确定量，同时操作耗时、烦琐、通量受局限，在临床应用不方便［8］。对Sanger 测序法和PCR-荧光探针法3 例不一致的样本进行分析，可能是PCR-荧光探针法和测序方法的检测靶标区域不同，两者引物的检测性能存在差异；另外，PCR-荧光探针法检测灵敏度较测序方法灵敏度高，也可能导致低浓度样本PCR-荧光探针法检测结果为阳性而测序方法检测结果为阴性。

实时荧光定量PCR 技术（PCR-荧光探针）的出现，实现了PCR 从定性到定量的巨大飞跃，为样品中靶标序列或基因片段的精确定量提供了一种简单而又方便的方法［9］。PCR-荧光探针技术以其操作简便、检测速度快、灵敏度高、同源分析特异性强、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具［10］，目前许多诊断应用也相继被开发。本研究通过三种方法同时检测鼻咽拭子中的HRV，试验结果表明PCR-荧光探针法可靠、准确、安全、简便、稳定，具有较高的临床应用价值。