副溶血弧菌病原学流行规律以及特征分析

曹利君 毕月 邓晓宇 黄瑛 刘晶

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是广泛分布在水产品中的一种嗜盐性革兰阴性细菌，也是导致水产品中毒的主要细菌，属弧菌科中的弧菌属，其进入人体后将引发多种疾病，例如急性胃肠炎和原发性败血症等［1-2］。既往研究证实，VP 主要致病作用在于其可产生两种毒力因子（直接溶血素tdh 和溶血相关毒素trh），部分毒株甚至可携带一种以上毒力因子，而误食被VP 污染后的产品可出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐等典型胃肠炎反应以及胃肠重复性感染等症状，严重者甚至会出现休克［3-4］。在沿海地区和国家，例如日本、台湾等，由VP 引起的细菌性食源性疾病占比＞50%［5］。而近年来，造成沿海地区食物中毒的主要致病菌是VP，不仅取代了原来的沙门菌，并且因该菌引起的细菌性食物中毒占＞40%，对公众的健康安全造成严重影响［6］。基于此，本研究围绕镇海区VP 感染患者病菌样本进行生物学特征分析，并探究影响VP 感染的危险因素，为后续该地区实现VP 感染的有效治疗及防控提供有效数据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源于收集 收集2020 年1 月至2022 年2月期间宁波市镇海区3 家综合性医院、5 家社区服务中心腹泻患者的粪便标本。腹泻的定义：排便≥3 次/d，并伴有水样便、黏液便、脓血便等性状改变。采集同时收集相关的临床资料，标本采用Cary-Blair 培养基专用运送。

1.2 细菌检测 按照国家科技重大专项传染病监测技术平台项目《腹泻症候群监测方案》要求的方法，粪便标本进行沙门氏菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌（肠致病性大肠埃希菌、肠出血性大肠埃希菌、产肠毒素性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌和肠集聚性大肠埃希菌）、霍乱弧菌、VP、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弯曲菌的分离培养；细菌鉴定采用法国生物梅里埃公司VITEK 全自动细菌分析仪及配套的鉴定板条进行。

1.3 血清分群方法 针对可疑菌落应用3%氯化钠溶液制备成10 mg/L 的菌悬液，置于121℃恒温环境下持续1 h 完成灭活；之后行离心操作获得上清液，加入5%甘油的3%氯化钠溶液完成重悬并滴15μL 分离的菌悬液在洁净玻片，摇动玻片40 s 观察其凝集状况，若存在明显凝集现象判定为阳性，无明显凝集反应判定为阴性，同时使用无菌生理盐水作为自凝对照。

1.4 PCR 扩增tdh 和trh 毒力基因 挑取米粒大小粪便（尽可能取黏液脓血部分），于放置有0.5 mL 生理盐水的离心管中振荡混匀，13,000 r/min 离心2 min。去尽上清液，沉淀中直接加入100μL 核酸抽提液充分混匀，沸水浴10 min。13,000 r/min 离心5 min，取上清液4μL做PCR 反应。取PCR 反应液（n×26μL）与TDHTRH-TLH 检测混合液（n×10μL）混合，震荡混匀数秒，3,000 r/min 离心数秒。取上述混合液36μL 于薄壁PCR 反应管或PCR 反应板中，然后将已处理标本、阳性对照品、阴性对照品各4μL 分别加入薄壁PCR 反应管或PCR 反应板中，盖好薄壁 PCR 反应管盖或PCR 反应板膜，立即进行PCR 扩增反应。反应管置于定量荧光PCR 仪上，37℃×2 min；94℃×2 min；循环1 次，再按93℃×15 sec →60℃×60 sec，循环45 次；单点荧光检测在60℃，反应体系为40μL。

1.5 药敏试验 采用法国生物梅里埃公司VITEK 全自动细菌分析仪及配套的药敏板条进行。质控菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠埃希菌（ATCC25922）。

1.6 观察指标（1）观察患者血清分群结果；（2）观察菌株毒力基因检测结果；（3）观察纳入样本的药敏试验结果；（4）观察VP 腹泻患者的临床特征；（5）VP感染的单因素分析；（6）二元Logistic 回归分析VP 腹泻患者发病的危险因素。

1.7 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。临床资料数据以n或%表示，行χ2检验，VP 发病的危险因素采用二元Logistic 回归分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征 收集VP 菌株对应患者的临床资料情况，显示存在87.60%（106/121）的患者排泄粪便呈水样，2 例患者（占比1.65%）的排泄粪便样为脓血状；腹泻频次为1～17 次/d，中位数为7 次；有10 例患者（占比8.26%）伴随腹痛症状，7 例患者（占比5.79%）伴有机体发热症状，平均体温为38.6℃。121 例VP 患者中，105 例患者（占比86.78%）采用抗生素治疗，85例患者（占比70.25%）采用输液治疗，32 例患者（占比26.45%）采用口服用药治疗，6 例患者（占比4.96%）采用输液和口服联合用药。

2.2 血清分群结果 121 株分离自患者粪便的VP 经血清凝集，共分为4 个血清群，其中O3 群共97 株，占比80.17%；O4 群共21 株，占比17.36%；O10 群发现2 株，占比1.65%；O8 群发现1 株，占比0.83%。上述血清分群结果显示第一优势群为O3 群，第二优势群为O4 群。

2.3 毒力基因检测结果 本研究对获取的121 株菌株样本均采用实时荧光PCR 方法检测其独立基因，显示121 株菌株毒力基因tdh 均为阳性，trh 均为阴性。见图1。

图1 采用实时荧光PCR方法对VP菌株进行检测及其tdh和trh基因表达的部分结果

2.4 药敏试验结果 在所用的抗菌药物中，VP 菌株对氨苄西林（AMP）耐药率最高，为85.12%，见表1。

表1 本研究纳入菌株样本的药敏测定结果情况

2.5 针对VP 感染的影响因素进行分析（1）单因素分析：根据本515 例腹泻患者VP 感染情况建立分组，分别为VP 感染组（n=121）及阴性对照组（n=394），对比两组患者临床资料数据，显示两组患者性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）；两组患者年龄、职业、发病时间、发病期是否食用水产品等比较差异具有统计学意义（P均＜0.05），见表2。（2）二元Logistic 回归分析发生VP 感染的危险因素：将表2 中P＞0.05 的因素作为自变量，发生VP 感染作为因变量，采用二元Logistic回归分析显示监测病例年龄为20～59 岁、5～10 月、进食水产食品是食源性疾病监测病例VP 感染的危险因素（P＜0.05）。

表2 两组患者临床资料数据差异比较［n（%）］

3 讨论

VP 主要致病作用在于其产生的溶血素，包括不耐热溶血素（TLH）、tdh、trh，其中tdh、trh 是主要致病因子，拥有毒力基因tdh 和/或trh 的为致病株，而无拥有这两个基因的为非致病株。本资料结果显示，tdh作为VP 的种特异性基因，菌株携带率为100%，trh 携带率为0%，其中O3 群占比80.17%，为第一优势血清群。需要注意的是，近年来我国抗菌药物应用率呈显著递增态势，相应的病原菌耐药性日益加剧，采用药敏试验结果表明，从患者粪便中分离到的VP 菌株对AMP耐药率最高，为93.3%，这与其他地区VP 菌株的耐药性研究结果存在一定差异，说明VP 的耐药性是动态变化的，VP 菌株耐药性差异可能与不同地区、不同就诊场所及应用的抗菌药物习惯不同，以及菌株来源不同等因素有关。

为了进一步分析镇海区VP 感染患者临床情况，本资料对该地区VP 发病的影响因素进行分析，显示年龄20～59 岁是VP 发病的危险因素之一，分析其原因，可能是该年龄段人群外出就餐频率较高，VP 感染风险加剧导致腹泻症状出现，既往有学者对其他地区的研究中也获得了相似结论［7］。因此，对于外出就餐频率较高人群，后续应对其积极开展相应的健康就餐相关宣教指导活动，引导该类人群做好行为管理，保持良好的饮食卫生习惯，树立健康饮食观念。此外，本研究通过单因素分析发现从事不同职业人群在VP 感染方面也存在明显差异（P＜0.05），但二元Logistic 回归分析结果显示职业因素并非VP 感染的危险因素。既往临床有研究表明，VP 腹泻病例中工人、农民群体的发病率较高，出现这一情况的原因可能与该类人群所处环境的卫生条件较差、自身经济收入水平较低、卫生管理及食品安全意识较差有关，但关于职业因素对VP 感染的影响效用仍有待展开进一步的调查研究。本资料结果显示，VP 感染多发作于5～10 月，这可能与镇海区气温环境有关，与既往关于浙江省其他地区VP 感染因素分析的研究结论基本一致［8］。相关数据显示，VP 在30℃～35℃环境下生长活性明显升高，因此在每年5～10 月期间，需要相关市场卫生监管部门加强卫生安全检查工作，并通过展开各种卫生饮食宣教工作来帮助该地居民养成良好饮食习惯，提高其食品安全意识，强化普通居民对食源性疾病的风险认识。

综上所述，VP 感染是镇海区腹泻病例的主要原因之一，其感染有明显的季节性高峰，并可能受到患者年龄、监测时间、进食水产食品的影响。提高食源性疾病的综合监测质量，加强腹泻病例的VP 菌株检测，开展有针对性的防病知识宣传，对于控制本地VP 腹泻病例疫情具有积极效用。