脊柱结核中PD-L1、LAG-3的表达及临床病理相关性分析

王新 王天香 耿艳华 施佳 梁木凤 周美玲 吴千叶

骨关节结核是最常见的肺外结核之一，而脊柱是骨关节结核最常见的发病部位之一，其发病率占骨关节结核的40%～50%［1］。脊柱结核是较严重的骨关节疾病，治疗不及时可导致椎体严重破坏、脊柱畸形和神经损害。近年来新兴的有关程序性细胞死亡配体-1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）和淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）等免疫检查点相关的免疫治疗日益受到关注，并在肿瘤治疗领域取得了不错的成果，然而在应用免疫检查点抑制剂的时候常会出现活动性结核病或结核复燃的情况［2］。因此，探索PD-L1、LAG-3 在骨结核中的表达对骨坏死和炎性浸润等疾病进展情况的影响，可加深对疾病的变化和发展的认识。LAG-3 也是重要的免疫抑制性受体，能负向调节活化的T 细胞的增殖和功能［3］。本研究通过分析PD-L1 和LAG-3 免疫组化的表达情况及对脊柱结核特有的病理形态变化的影响，并探索其临床病理相关性，以期更深入了解其在骨结核中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 组织标本及临床资料 选取自2021 年6 月至2022年9 月于杭州市红十字会医院就诊的50 例脊柱结核患者的石蜡标本设为观察组，11 例非结核炎症性脊柱标本设为对照组。所选标本患者均无免疫系统相关严重疾病，无人免疫缺陷性病毒阳性，近期无应用免疫调节剂。61 例标本中男45 例，女16 例；年龄18～58 岁，平均（54.6±1.4）岁，中位数年龄54.0 岁；其中≥50岁患者40 例，＜50 岁21 例；所有病例均通过病史、临床表现、实验室病原学、相关免疫学检测及病理学形态学表现确诊。

1.2 仪器和试剂 浓缩型兔抗人LAG-3 抗体（克隆号：EPR20261）采购自美国Abcam 公司；浓缩型兔抗人PD-L1 抗体（克隆号E1L3N）采购自厦门艾德生物公司；常规染色试剂盒、免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒均采购自北京中杉金桥生物技术有限公司；光学显微镜采购自日本奥林巴斯公司。

1.3 免疫组化（IHC）采用SP 法二抗试剂盒进行孵育，DAB 显色，苏木精衬染细胞核，显微镜下观察细胞染色情况，胞浆和胞膜染色成黄色，含有粗细不一的棕黄色颗粒即为阳性细胞。使用奥林巴斯BX41 显微镜及图像采集系统采集图像，所有切片分析在同一强度、同一放大倍数下进行。采用image J 图像分析软件［4］（1.8.0，NIMH）对免疫组化的表达进行平均光密度值分析测量。每张切片随机选取5 个不重叠的高倍镜视野（×400），计算每个视野下阳性细胞的平均光密度值［5］。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件。符合正态分布和方差齐性的计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验。根据双变量是否符合正态性分布采用Pearson 或Spearman 相关性分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脊柱结核组织不同标本中的HE 及抗酸染色情况 见图1。

图1 HE及抗酸染色。A.骨小梁间可见典型结核肉芽肿（HE，×200）；B.伴有复杂炎性背景的脊柱结核（HE，×200）；C.脊柱结核标本可见抗酸染色阳性（抗酸染色，×200）

2.2 PD-L1 和LAG-3 在脊柱结核组织不同区域中的表达情况 PD-L1 阳性主要位于结核病灶中的类上皮细胞及单核细胞，胞膜及胞质棕黄色颗粒即为阳性细胞。LAG-3 阳性主要位于结核结节周边淋巴细胞及分叶核粒细胞。PD-L1 和LAG-3 免疫组化染色阳性结果见图2。PD-L1 在脊柱结核组织中的平均光密度值为（10.6×104±8.2×104）高于对照组（1,315.8±1,605.7），差异有统计学意义（P＜0.05）。LAG-3 在观察组的平均光密度值为（2.7×103±2.5×103）低 于对照 组（7.2×103±13.7×103），差异无统计学意义（P=0.0657＞0.05），见图3。

图2 PD-L1和LAG-3在脊柱结核病灶组织中的表达情况。A.PD-L1在脊柱结核组织中的表达（SP，×400）；B.LAG-3在脊柱结核组织中的表达（SP，×400）

图3 观察组和对照组中PD-L1和LAG-3表达的比较（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.3 PD-L1 和LAG-3 的表达与脊柱结核临床病理特征及其他变量的关系 PD-L1 在病理形态学表现有典型结核肉芽肿的病例中高表达，在具有复杂的炎症性背景为主的病例中低表达，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与抗酸染色、年龄、性别等无关（P＞0.05）；LAG-3 表达与脊柱结核患者标本中病理形态学类型、抗酸染色、年龄和性别等均无关（P＞0.05）。

2.4 PD-L1 和LAG-3 在脊柱结核组织中表达的相关性分析 椎体骨结核标本中PD-L1 和LAG-3 平均光密度值相关性分析显示，PD-L1 与LAG-3 呈中度负相关性（r=-0.4，P＜0.05）（图4）。

图4 LAG-3与PD-L1的相关性

3 讨论

脊柱结核约占骨关节结核的半数以上，若治疗不及时，椎体及椎间盘受累加重，可导致脊柱塌陷、结核累及椎管引起截瘫或其他严重并发症，严重影响患者生活质量［6］。

PD-L1 与PD-1 结合后，可激活一系列信号通路，抑制免疫细胞的过度激活，从而减少免疫细胞分泌抗体和细胞因子，是人体避免过度免疫自我保护的机制。而肿瘤细胞可以自我生成PD-L1，甚至耗尽免疫细胞，从而实现免疫逃逸［7］。LAG-3 是重要的免疫抑制性受体能够抑制T 细胞增殖，负向调节活化的T 细胞的增殖和功能。较强的T 细胞受体（T cell receptor，TCR）信号诱导较高LAG-3 的表达，表明LAG-3 的诱导可能充当负反馈以防止免疫反应的过度激活［3］。

本资料显示在脊柱结核中LAG-3 表达主要局限于结核结节周围的中性分叶核粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞；PD-L1 表达主要位于结核结节的类上皮细胞。且PD-L1 的表达情况明显高于LAG-3。在相关性分析中发现PD-L1 与LAG-3 呈负相关性（r=-0.402，P＜0.05）。本研究显示，形态学上部分病例是以骨小梁间典型的肉芽肿结节或少量不典型上皮样组织细胞结节反应伴凝固性坏死，而其他类型炎症细胞相对少见。其余病例则是以非典型的结核形态学，即以明显复杂的炎症性背景伴以散在无规律单核巨噬细胞增生，偶可伴有少量不典型肉芽肿。而研究还显示了病理形态学表现为明显复杂的炎症性病例组中背景除单核巨噬细胞增生外可伴有少量不典型肉芽肿，但PD-L1 均值较病理形态学为典型结核肉芽肿脊柱结核标本组低，且具有统计学差异（t=-2.806，P＜0.05）。这与相关报道的结果是一致，该报道认为脊柱结核的典型病理表现是结核肉芽肿性炎，人体主要是通过肉芽肿将结核杆菌与受累组织分隔开而限制了感染的播散，但是这种隔绝又会限制机体对细菌的清除［8］。有研究表明，在感染及肿瘤病例中PD-1/PD-L1 组成的通路可导致T 细胞功能耗竭［9］。李奇凤等［10］的研究表明结核病儿童外周血中PD-1/PD-L1 基因表达水平明显高于健康儿童。这与食蟹猴结核病模型报道的结果是类似的，该模型的报道显示表达LAG-3或PD-1的大多数T细胞并未发生免疫功能的衰竭［11］。表明在脊柱结核结节中PD-L1 的高表达可能存在独立于局部活化的T 细胞的PD-1/PD-L1 信号通路，并可能是发挥下调免疫功能的主要通路。有文献显示TGF-β 可以在结核中高表达［12］，并通过smad2/3或者nonsmad2/3（PI3K/Akt/TOR）通路调控PD-L1 的表达上调，从而导致T 细胞的免疫受到抑制［13］，这与脊柱结核由复杂炎症反应阶段进展至T 细胞免疫耗竭后形态上表现出较多肉芽肿并发生多量干酪样坏死，且不易局限的结果是一致的。

本资料结果显示，相关抗体PD-L1 在典型脊柱结核中表达较明显，推测这可能与免疫反应中TGF-β 调控PD-L1 表达上调相关通路的启动有关［14］。而具有典型结合表现的病灶中T细胞表达的LAG-3显著减少，与最终导致的T 淋巴细胞免疫受到抑制的表现一致［9］。骨结核病理表现以骨小梁间混合性炎性增生为主的病例，虽在形态学上并不一定能够出现多量、典型的肉芽肿和凝固性坏死，常以增生的单核组织细胞为特征伴有较为复杂的炎症性背景，此时从形态上结核病的特征性表现并不十分典型，形态上常需要考虑排除是否合并有其他感染，但此类病变却相对容易出现结核抗酸染色阳性，本研究中的抗酸杆菌阳性病例，均出现在了这些病例中。这类病变中，除存在较明显的单核组织细胞PD-L1表达外，LAG-3 也均阳性表达在其他炎症性背景细胞中，此时的炎症性反应较为明显，除有增生的单核组织细胞外，还有一定数量的淋巴细胞，少量中性粒、浆细胞参与，也可以见到血管和少量的纤维母细胞等炎症反应背景，此时并未较大范围形成坏死，组织中的凝固性坏死并不突出、易见。这也与凝固性坏死未大范围形成之前，T 细胞免疫功能及T 数量未完全耗竭的表现是一致的［11］，此时临床上可以出现较明显的结核中毒症状及局部疼痛表现。此时，如果机体的抵抗力足够顽强、有效，或者能够及时确诊和得到有效药物治疗干预，病变或许是能够获得有效控制的。但因脊柱结核病灶以骨小梁间血管间质受累在先，在免疫抑制发生后，病变进展，继而导致组织进一步坏死，但骨小梁间空间狭小、间质少，免疫反应亦不能有效抑制致病菌，导致骨小梁发生溶蚀破坏，并进一步沿着小梁间隙蔓延，病变难以局限形成类似于肺结核结节及淋巴结结核结节局限性纤维化、钙化包裹结节，直至病变侵袭周围软组织，形成结核冷脓肿病变不能有效局限于骨内的情况，这也许正是脊柱结核难以形成类似于肺结核结节和淋巴结结核后期纤维化、钙化、包裹结节等自限性改变的情况，随着病情的进展，而终须行外科病灶清除治疗的原因。

上述结论也许能为脊柱结核病在发展的早中期阶段能及时确诊并进行相关免疫治疗干预和相关靶向治疗，在病变尚未形成不可逆转的组织损害前有效阻止病变的进展提供有益的参考。