LncRNA H19及miRNA 130a表达水平与冠状动脉狭窄程度的相关性分析*

翟宇新 ，张斌强，钱航，徐先琳，唐俊，王双双，陈继舜

（1.锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地，湖北 十堰 442008；2.湖北医药学院附属国药东风总医院，湖北 十堰 442008）

我国的冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease,CAD）发病率及死亡率仍呈上升趋势，是严重影响了人类健康的公共卫生问题［1］。对CAD 的早期诊断以及病情评估可以改善CAD 患者的预后提高其生活质量［2］。目前研究发现长链非编码RNA（LncRNA）和微小RNA（miRNAs）在心血管疾病的相关研究中具有重要地位，它们直接或间接的影响着CAD 的发生与发展［3-4］。其中长链非编码RNA H19（LncRNA H19）和微小RNA 130a（miRNA 130a）通过调控多种机制参与心血管疾病的进展［5-6］。目前LncRNA H19、miRNA 130a 在血浆中的表达量与冠状动脉狭窄程度的关联性没有明确的研究，因此本研究拟分析临床患者血浆中LncRNA H19 与miRNA 130a 的表达水平的变化，探究LncRNA H19 与miRNA 130a的表达水平是否与冠脉狭窄程度存在关联性，旨在为CAD 的早期诊断及病情判断提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2021 年7 月至2021 年10 月就诊于湖北医药学院附属国药东风总医院心血管内科且均行冠状动脉造影（CAG）明确冠状动脉血管情况的住院患者共92 例为研究对象，男48 例，女44 例，年龄≥18 岁，患者及家属均知情同意。同时，院内采集基础资料及一般临床生化指标。排除标准：肝、肾等重要脏器功能不良者；存在行为认知障碍等无法完成知情同意的患者；对实验造成影响的其他血管疾病。本研究经医院伦理委员会审批。

1.2 实验分组

依据CAG 结果分为CAD 组（冠状动脉主要血管狭窄大于50%）和对照组（非CAD 组），冠状动脉造影根据标准由二名有丰富经验的副主任医师及以上职称的医生对冠状动脉造影结果进行判定。根据Gensini 评分中位数［7］，将CAD 组进一步分为2 个亚组：低分组，Gensini 评分＜40 分；高分组，Gensini 评分≥40 分。

1.3 实验方法

1.3.1 收集血液标本 患者入院第二天清晨，收集空腹外周静脉血5 mL，经3 500 r/min 转速持续离心15 min（美国Thermo Heraeus Pico 17/21 微量离心机），离心半径10 cm，取部分上清液加Trizol混匀于-80℃冰箱保存备用。送5 mL 静脉血送检验科检验白蛋白、血尿酸、碱性磷酸酶、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等相关指标。

1.3.2 LncRNA H19 检测将冻存血浆样本使用 Trizol 法提取总 RNA 。使用紫外分光光度计测定 RNA 水平；设计引物正向：5′-TGCTGCACTTTACAACCACTG-3′，反向：5′-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3′，内参使用β-actin，正向引物：5′-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3′，反向引物：5′-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3′，依照 天根科技有限公司lnRcute lncRNA cDNA 第一链合成试剂盒（KR202）说明书反转录得到cDNA。每个样本cDNA 取2 μL 加入天根科技有限公司lnRcute lncRNA 荧光定量检测试剂上荧光定量PCR 仪检测（博日实时荧光定量PCR 仪9600plus），PCR 反应条件为：95℃ 3 min，1 个循环；95℃ 5 s，50℃10 s，72℃ 15 s，40 个循环。应用Taq-Man 探针实时定量荧光聚合链反应（qRT-PCR）和PCR 双重特异引物扩增技术检测LncRNA H19 的Ct 值。

1.3.3 miRNA 130a 检测 取冻存血浆样本200 μL使用miRcute miRNA 提取分离试剂盒（天根科技有限公司）分离出miRNA。使用设计成熟的miRNA 130a 的特异性引物（天根科技有限公司），并加入miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂逆转录获取cDNA。每个样本cDNA 取2 μL加入天根科技有限公司miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）（FP411）上荧光定量PCR 仪检测，PCR 反应条件为：95℃15 min，1 个循环；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40 个循环。检测miRNA 130a 的Ct 值。

所有目的基因表达倍数按2-ΔΔCt的公式计算得到。所有反应重复三次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。计量资料经正态性检验，符合正态分布的以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的以中位数和四分位数间距M（P25,P75）表示，两组间比较采用非参数检验；计数资料用频数表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman 检验分析两变量间的相关程度和方向，取双侧检验；采用受试者工作特征（ROC）曲线评估相关指标对结局的诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料比较

通过CAD 组与对照组一般临床资料比较可得出：两组总胆固醇、HDL-C、LDL-C、白细胞等差异有统计学意义（P＜0.05），其余指标差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 对照组与CAD 组患者一般临床资料比较

2.2 不同组别血浆中LncRNA H19 及miRNA 130a 的表达情况

CAD 组血浆中LncRNA H19 表达水平高于对照组，miRNA 130a 表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。依据Gensini 评分标准，将CAD 组进一步分为两组，低分组30 例，高分组31 例，高分组血浆中LncRNA H19 表达水平高于低分组，miRNA 130a 表达水平低于低分组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、表3。

表2 对照组与CAD 组患者血浆LncRNA H19 及miRNA 130a 表达水平比较 ［M（P25,P75）］

表3 不同Gensini 评分患者血浆LncRNA H19 及miRNA 130a 表达水平比较 ［M（P25,P75）］

2.3 血浆中LncRNA H19 及miRNA 130a 表达水平与Gensini 评分的相关性分析

根据Spearman 检验分析后可知，CAD 患者血浆中的LncRNA H19 表达水平与Gensini 评分呈正相关（r=0.481,P＜0.05），即LncRNA H19 表达水平越高，冠状动脉狭窄程度越重；而miRNA 130a的表达水平与Gensini 评分呈负相关（r=-0.386,P＜0.05），即miRNA 130a 表达水平越低，冠状动脉狭窄程度越重。

2.4 血浆中LncRNA H19、miRNA 130a、二者联合对CAD 及其严重程度的诊断效能

LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者联合诊断CAD 的曲线下面积（AUC）分别为 0.685（95%CI：0.569～0.801，P＜0.05，灵敏性0.836，特异性0.452）、0.804（95%CI：0.701～0.908,P＜0.05，灵敏性0.903，特异性0.613）、0.821（95%CI：0.728～0.914,P＜0.05，灵敏性 0.918，特异性0.613）。在此基础上，进一步诊断冠状动脉狭窄程度 的AUC 分别为0.777（95%CI：0.661～0.894,P＜0.05，灵敏性0.933，特异性0.516）、0.723（95%CI：0.597～0.850,P＜0.05，灵敏性0.516，特异性0.900）、0.836（95%CI：0.733～0.938,P＜0.05，灵敏性0.774，特异性0.867）。通过比较发现，单独LncRNA H19 或miRNA 130a 的AUC 值低于二者联合的AUC 值，且灵敏性与特异性较二者单独诊断有所提高，因此推断二者联合在一起具有更好评估冠状动脉狭窄程度的效能，见图1、图2。

图1 血浆中LncRNA H19、miRNA 130a 及二者联合诊断CAD 的ROC 曲线

图2 血浆中LncRNA H19、miRNA 130a 及二者联合诊断冠状动脉狭窄程度的ROC 曲线

3 讨论

CAD 是临床中常见的心血管疾病，其基础病理改变是血管动脉粥样硬化引起管腔狭窄，可以导致心肌缺氧缺血从而引发心绞痛，严重时血管闭塞，甚至可引起心肌梗死，危及患者的生命［8］。早期诊断CAD，更积极地控制其危险因素，可以改善患者预后。相关研究显示，LncRNA 和miRNA 通过多种途径影响着CAD 的发生发展。

Gensini 评分是目前临床上评价冠脉狭窄程度的常用方法，冠状动脉病变越严重则Gensini 评分越高。本研究显示，CAD 组及CAD 高Gensini 评分组患者血浆中LncRNA H19 的表达高于对照组。PAN 等［9］在临床研究中发现在动脉粥样硬化的患者血清中LncRNA H19 表达含量异常。提示血浆中LncRNAH19 的表达情况可能参与CAD 的发生发展。本次研究发现，随着冠脉血管狭窄程度的增加，LncRNAH19 在血浆中的表达水平逐渐升高。相关研究显示，LncRNA H19 的过表达可以促进斑块内毛细血管形成，新生的毛细血管可以增加血管粥样硬化区域的营养和局部的氧气供应，加快动脉粥样硬化斑块的发展［10-11］。在CAD 患者血清中，LncRNA H19 呈高表达，且与血管内皮生长因子（VEGF）水平呈正相关。由此推测LncRNA H19 可能通过相关通路调控VEGF 的表达［12］。而在经血清剥夺处理的小鼠间充质干细胞中，加强LncRNA H19 表达可以靶向抑制miR-199a-5p，双荧光素酶报告试验提示VEGF 是miR-199a-5p 下游的靶标［13］。VEGF 可以通过促进内皮细胞增殖、提高管壁通透性、介导炎性细胞浸润等多种方式增加新生血管密度，进一步加剧粥样斑块的不稳定性［14］。另外有报道显示，泡沫细胞中的LncRNA H19 过表达，可以抑制脂质的代谢、增加脂类沉积，导致泡沫细胞中的脂代谢紊乱，从而加重血管粥样硬化［15］。结合上述相关研究推测：LncRNAH19 可能通过调控斑块内毛细血管的生成以及脂代谢紊乱的发生参与CAD 的进展。

血管内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化斑块形成的重要条件之一［16］。有报道显示，miRNA 130a可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和凋亡［17］。本次研究显示，miRNA 130a 在CAD 组血浆中的表达低于对照组，提示miRNA130a 可能参与CAD 的发生。通过Gensini 评分进一步将CAD 患者分为低分组和高分组，分析显示，低分组、高分组血浆中miRNA 130a 的表达水平逐渐降低。有研究发现，miRNA 130a 通过抑制人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）来减轻血管内皮细胞的损伤，进而影响了CAD 的发生发展［18-19］。同时有报道称，在脂质沉积的小鼠网膜脂肪组织细胞中miRNA 130a 呈高表达，这种相对含量变化提示miRNA 130a 可能参与了脂代谢紊乱的调节，并影响了冠状动脉粥样硬化的进程［20］。在动物实验研究中，用miRNA 130a 抑制剂处理的年轻血管内皮细胞会导致其衰老进程加快，并降低其血管生成能力。与之相反的是，在衰老的血管内皮细胞中提高miRNA 130a 的表达水平可减缓内皮细胞的衰老进程并改善血管生成情况［21］。内皮细胞衰老会导致蛋白水解酶活性和降解速度均降低，胶原蛋白的合成和分解失衡，血管壁上胶原蛋白沉积以及弹性蛋白减少，造成冠状动脉粥样硬化［22］。这提示着miRNA 130a 可以通过延缓细胞衰老减缓CAD 的进程。结合本次研究推测血浆中miRNA 130a 的表达水平与冠状动脉狭窄程度呈负相关，miRNA 130a 可参与CAD 的发展演变，在一定程度上其表达水平变化可以反映CAD 严重程度。

有研究表明，血清中的LncRNA H19 对CAD有一定的诊断价值［23］。本实验结果示：LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者联合诊断CAD 的AUC分别为 0.685、0.804、0.821，证实血浆中LncRNA H19、miRNA 130a 对CAD 具有一定的诊断效能，而二者联合诊断CAD 预测效能较二者单独诊断更高。在上述结论的基础上，本次研究进一步分析了血浆中LncRNA H19、miRNA 130a 以及二者联合对冠状动脉狭窄程度的诊断效能，实验结果显示LncRNA H19、miRNA 130a 以及LncRNA H19 联合miRNA 130a 诊断冠状动脉狭窄程度的AUC 分别为0.777、0.723、0.836。根据上述结果可以推测，LncRNA H19、miRNA 130a 可以在一定程度上诊断冠状动脉狭窄程度，并且LncRNA H19 联合miRNA 130a 诊断效能更高，这为CAD 的临床诊断提供了新的思路。

综上所述，LncRNA H19、miRNA 130a 与CAD 具有密切的关系，对于CAD 严重程度的早期诊断具有重大的意义。本次研究首次得出，随着冠状动脉狭窄程度的增加，CAD 患者血浆中LncRNA H19 的表达水平升高，而miRNA 130a 的表达水平降低。由此可以推测，LncRNA H19、miRNA 130a 可以在一定程度上诊断冠状动脉狭窄程度，并且LncRNA H19 联合miRNA 130a 对冠状动脉狭窄程度诊断效能更高。这些指标在诊断评估CAD 严重程度的发展中具有潜在的临床参考价值，值得进一步研究。