热力学平衡对加速稳定性的影响

叶鹏茹，王万利，王萍，陶占领，渠海

（郑州安图生物工程股份有限公司，河南 郑州 450016）

磁微粒化学发光技术因其灵敏度高、线性范围宽、选择性强、快速简单、自动化等诸多优点已经广泛用于检测甲状腺、激素、心肌损伤、肿瘤标志物、传染病、贫血、骨代谢等［1-4］，在体外临床诊断有着广泛的应用和巨大的前景［5-6］。目前市场上产品质量参差不齐，因此必须要全面提高产品的性能，其中产品稳定性作为评价体外诊断试剂保持产品性能的重要指标，提高产品的稳定性对于产品的研发、生产、运输、保存和使用等环节至关重要。众所周知，影响磁微粒化学发光试剂稳定性的因素有很多，例如：缓冲液的种类、pH、离子强度、表面活性剂、糖类、酶标记方法等［7-12］，甚至是更换原料也可能会导致活性减弱或丧失，稳定性变差。

有研究表明可以通过预热处理方法来控制蛋白质颗粒的大小、变性和聚集，从而提高蛋白稳定性，是目前最简单、有效的方法之一［13-14］。在加热过程中蛋白质结构会发生一定的变化，分子内和分子间重组等因素增强了热稳定性，抑制蛋白分子聚合，维持结构相对稳定，从而改善稳定性［14-15］。因此，根据启发在本研究中笔者提出通过预热平衡这种简单的方式来增加磁微粒化学发光试剂的稳定性。

通常情况下，升高温度来考察加速稳定性是最常用的方式，即通常所讲的热稳定性，因此本研究主要通过考核热稳定性来验证平衡对产品稳定性的影响。本文主要以磁微粒β2-MG 检测试剂盒为例，通过对试剂进行预热平衡处理来稳定活性材料与辅料的结构，进而提高产品稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磁微粒β2-MG 化学发光检测试剂盒；酶标抗体（郑州伊美诺生物技术有限公司）：酶结合物稀释液：0.02 M pH=7.4 PBS 缓冲液含1% 牛血清白蛋白（BSA）和1‰ P300。

1.2 仪器与设备

全自动化学发光测定仪Auto Lumo A2000 Plus（安图生物）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器材有限公司）

1.3 试验方法

1.3.1 不同平衡方式对稳定性影响研究 对酶结合物进行不同的平衡处理来验证对稳定性的影响。①平衡酶标抗体：酶标抗体原液37℃温箱放置3 d后取出，在2～8℃冰箱放置过夜，然后用新鲜配制的酶结合物稀释液将其稀释至所需浓度；②平衡酶结合物稀释液：将新鲜配制的酶结合物稀释液37℃温箱放置3 d 后取出，在2～8℃冰箱放置过夜，然后此酶结合物稀释液将酶标抗体原液稀释至所需浓度；③平衡酶结合物：将新鲜配制的酶结合物工作液37℃温箱放置3 d 后取出，在2～8℃冰箱放置过夜；④分步平衡：将新鲜配制的酶结合物稀释液37℃温箱放置3 d 后取出，在2～8℃冰箱放置过夜，然后用此酶结合物稀释液将酶标抗体原液稀释至所需浓度得到酶结合物工作液，然后在37℃温箱放置3 d 后取出，2～8℃冰箱放置过夜；⑤对照不平衡：新鲜配制的酶结合物工作液在2～8℃冰箱保存；以上5 组试剂用0.22 μm 的过滤器过滤后，分别将其放置2～8℃、37℃ 10 d 后进行稳定性考核。

1.3.2 平衡温度对稳定性影响研究 将新鲜配制的酶结合物在在25℃、37℃、45℃电热恒温培养箱放置3 d 后取出，2～8℃冰箱放置过夜，然后将其放置2～8℃、37℃ 10 d 后进行稳定性考核。

1.3.3 平衡时间对稳定性影响研究 将新鲜配制的酶结合物在在37℃温箱放置1、3、5、7 d 后取出，2～8℃冰箱放置过夜，用0.22 μm 的过滤器过滤后将其放置2～8℃、37℃ 10 d 后进行稳定性考核。

1.3.4 酶标抗体稀释液平衡对稳定性影响研究用新鲜配制的酶结合物稀释液将酶标抗体稀释20 倍，在37℃电热恒温培养箱放置1、3、5、7 d后取出，2～8℃冰箱放置过夜，然后用新鲜配制的酶结合物稀释液将其至所需浓度，放置2～8℃、37℃ 10 d 后进行稳定性考核。

1.3.5 加样和反应模式 在反应杯中分别加入100 μL 标准品（浓度值分别为0 μg/L、50 μg/L、150 μg/L、400 μg/L、1 000 μg/L、4 000 μg/L），20 μL 磁微粒试剂和100 μL 酶结合物震荡混匀，37℃反应17 min，洗涤5 次，加激发液和预激发液各50 μL，测定发光值（relative light unit,RLU）。

1.3.6 检测指标 IVD 行业一般认为试剂盒在37℃放置10 d 相当于2～8℃贮存18 个月效期，所以试剂盒组分都需要考核37℃放置10 d 的性能指标，本文重点考察标准品发光值变化，实验将放置37℃ 10 d 后各研究方法配制的试剂与2～8℃试剂同时对比检测，计算配对浓度点的发光值下降率（rate of decline,ROD）（%）=（RLU37℃10d/RLU2～8℃－1）均值为标准品各浓度ROD 的平均值。

1.4 统计学方法

本文选择较优的方案，用酶标稀释液平衡7 d与对照不平衡2～8℃的试剂同时测定22 份样本，采用SPSS 17.0 软件对结果进行配对样本行t检验，计算出P值，若P＞0.05，则酶标稀释液平衡后的试剂与对照试剂两组数据之间差异无统计学意义。

2 结果

2.1 不同平衡方式对稳定性影响研究

不同平衡方式对磁微粒化学发光试剂稳定性影响结果见表1。通过对比不同平衡方式，笔者发现不同平衡方式之间稳定性有一定的差异，其中平衡酶结合物与分步平衡对稳定性有明显改善，且两者无显著差异，ROD 均值由30.37% 减少至19%左右，而平衡酶结合物稀释液对稳定性改善没有效果。因此后续以平衡酶结合物方法进一步验证平衡时间及平衡温度对稳定性的影响。其中值得注意的是，经过平衡后的酶结合物的试剂检测的发光值有一定的下降，后续需着可进一步研究这种变化对临床检验是否产生影响。

表1 不同平衡方式稳定性结果比较

2.2 不同平衡温度对稳定性影响研究

由表2 可知，不同平衡温度对稳定性改善能力有一定区别，其中在25℃条件下平衡3 d 时，ROD 仅改善3%左右，此外温度过高可能导致发光试剂失活，结构发生变化，因此，后续均选用37℃作为平衡温度。

表2 平衡温度稳定性结果比较

2.3 不同平衡时间对稳定性影响研究

不同平衡时间对磁微粒化学发光试剂稳定性影响结果见表3。由结果可知随着平衡时间的延长，稳定性也随之越好，当热平衡时间增加到7 d时，ROD 均值由28.84%减少至17.09%。

表3 不同平衡时间稳定性结果比较

2.4 酶标抗体稀释液平衡对稳定性影响研究

为减少生产操作难度，笔者又进一步评估预先稀释的酶标抗体经平衡后能改善稳定性，结果见表4。由结果可知，酶标稀释液平衡7 d 后，ROD 均值减少至18.85%，与直接平衡酶结合物7 d（ROD 均值17.09%）无明显差异；因此采用酶标稀释液平衡7 d 与对照不平衡2～8℃的试剂检测22 份样本进行比较 （P=0.8473），见表5。

表4 酶标抗体稀释液平衡稳定性结果比较

表5 22 份样本的配对样本t 检验结果（μg/L）

3 讨论

产品稳定性是体外诊断试剂保持产品性能的重要指标，而在磁微粒化学发光试剂盒中，磁微粒发光试剂是最主要的组分之一，但由于活性材料与酶形成发光复合物后可能导致某些结构上的改变，同时会受到外界溶液酸碱性、离子强度、表面活性剂、糖类等的变化［7-12］，通过疏水相互作用、范德华力、静电作用以及水化作用等相互作用引起原有蛋白或分子上的某些活性基团受到破坏，造成试剂稳定性差，最终影响检测结果的准确性。

由于通过热平衡使发光试剂中的活性材料在溶液中与其他组分结构发生变化，使结构得到充分伸展，此外分子内和分子间重组等相互作用，增强了稳定性，抑制蛋白分子聚合，维持结构相对稳定，从而使加速稳定性降幅变小，提高磁微粒化学发光试剂盒的稳定性。综上所述，通过热平衡处理，可以在不改变试剂成分的情况下提高磁微粒发光试剂的稳定性，为体外诊断试剂同行提供一种新思路。