3D生物打印中复合水凝胶生物墨水的研究进展*

孙兆丰 ，王国栋 ，翟传兴 ，张元民

（1.济宁医学院 临床医学院，山东 济宁 272067；2.济宁医学院附属医院 骨关节外科，山东 济宁 272067）

三维（3D）生物打印是一种按预先设计的方案进行生物材料精确可控的增材制造技术［1］。挤压和喷墨是目前基于喷嘴的生物打印最常见的模式，而激光诱导正向转移和数字激光打印是两种常用的激光3D 生物打印［2］。生物墨水的合成、交联对生物组织的构造，特别是对组织的机械性和细胞行为有很大的影响［3］。因此，生物墨水的设计是3D 生物打印关键的步骤之一。水凝胶是由高度亲水的聚合物组成的松散交联网络，具有很高的渗透性，允许细胞迁移，可以在不损伤细胞的同时交联并能将支架内的细胞的生理压力降至最低［4］。这些特性使水凝胶能够接近模拟细胞的自然微环境，使其成为3D 生物打印的最佳选择。

设计优良的生物墨水应具备支持细胞外基质的合成及沉积和植入后不会引发先天或获得性免疫反应等特点［5］。此外，预处理和后处理参数必须能够保持材料的生物相容性、打印保真度、剪切稀释、机械强度等特性［6］。目前的研究需开发出有效加强水凝胶，同时保持良好的生物特性的复合水凝胶，常用的技术包括多材料、互穿网络（interpenetrating polymer network，IPN）、纳米复合材料、超分子生物墨水，这些生物墨水增强方法从不同途径改善水凝胶的力学性能，包括增强交联度、均匀应力分布和通过牺牲键耗散机械能［7］。本文旨在对这几种技术的生物墨水合成和生物制造的趋势进行概括，并尝试评估这些新型生物材料转化为临床使用的潜在应用。

1 水凝胶的分类和结构

水凝胶是具有3D 网络结构的交联聚合物链，其亲水官能团（如-OH、-NH2、-COOH 和-SO3H）的存在决定了水凝胶的吸水性、不溶解性和力学性能，根据来源，水凝胶可以分为天然、合成或半合成聚合物，天然水凝胶具有分级多孔结构、生物相容性、渗透性、伸缩性、粘弹性和类组织特性，从物理化学的角度来看，与天然组织细胞外基质（ECM）非常相似［8］。天然水凝胶包括多糖、蛋白质和动物衍生物，比如海藻酸盐、明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纤维蛋白原、透明质酸和纤维素等，然而因为力学性能低，稳定性差，通常与物理交联机制有关，从而限制了其在生物组织工程的应用［4］。合成水凝胶是由合成聚合物构成的，相对于天然水凝胶，其具有良好的生物相容性、生物降解性、功能性和机械性能，比较常见的合成水凝胶主要由聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯或聚乳酸-聚乙醇酸等单体聚合制备，半合成聚合物是化学改性的天然聚合物或天然和合成聚合物的组合，常用于制备半水凝胶［9］。此外还有天然和合成聚合物的组合，如聚乙二醇结合壳聚糖，海藻酸盐与甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）结合等。这些水凝胶不仅具有天然水凝胶的生物活性特征，而且通过其不同的化学参数具有多种可调性质［10］。目前水凝胶因其的力学、组织粘附性和可调性使其适合于各种应用，包括伤口愈合、药物和细胞输送癌症治疗、增强抗炎作用、生物电子学、和组织再生［11］。

2 复合水凝胶生物墨水

复合水凝胶生物墨水是一种新兴的方法，指两种或两种以上不同的生物材料水通过物理缠结、化学交联和离子相互作用等多种机制一种生物墨水的混合物［12］。依据添加剂的空间分布和取向，复合生物油墨可以具有各向同性或各向异性的特性，在单网络水凝胶生物墨水的基础上，通过在多材料水凝胶网络中设计新的机械耗能机制来改善水凝胶生物墨水的力学性能，以及改善生物墨水的流变特性提高可印刷性，以致于目前关于多材料生物墨水的相关研究非常多样化，包括互穿网络、纳米复合材料、超分子生物油墨、聚合物功能化等［13］。

2.1 半/互穿网络生物墨水

IPN 生物墨水因其独特的微观结构和力学性能让人们对其的开发越来越感兴趣。IPN 生物墨水由两个单独的聚合物网络通过共价或离子交联或两者结合在一起，如果IPN 中只有一个聚合物是交联的，而其他聚合物具有线性结构，则形成半IPN［14］。IPN 的形成不仅保留了每种网络结构的特点，提高了交联网络的稳定性和力学性能，并有较好的粘附性、降解性。为了适应组织或器官的特定要求，利用不同聚合物网络组合的协同作用来调节所产生的IPN 生物墨水在3D 生物打印中展现出了巨大的潜力。目前已在药物输送和组织工程、伤口敷料、生物致动器、微传感器和渗透剂中得到广泛应用［15］。

IPN 主要分为双交联网络（dual-cross-linked network，DCN）和离子-共价纠缠（ionic-covalent entanglement，ICE）网络两大类。DCN 是指两个网络都通过共价交联连接在一起，它具有很高的键能，几乎与应变率无关，有较好的力学性能［14］。比如明胶和壳聚糖（chitosan,CS）是广泛应用于组织工程支架的天然生物材料但单纯的明胶或CS 水凝胶的力学性能较差，因此SUO 等［16］提出了明胶与CS 水凝胶通过共价键形成互穿网络（IPN）生物墨水，利用光交联和碱化作用实现了疏水相互作用。通过压缩和拉伸模数、极限拉伸应力和应变的表征进行验证时，发现该生物墨水有较好的力学性能和生物相容性。ICE 网络是指即由离子交联的刚性聚合物和共价键交联的弹性聚合物形成的，相比于共价交联，其具有具有更强韧性［17］。例如CHIMENE 等［18］把共价交联Gelma、离子交联卡拉胶进行交联形成离子-共价纠缠网络，并与纳米硅酸盐相结合形成了纳米工程离子共价缠结生物墨水，测试支架发现其有较好的印刷适性，机械性能和降解特性，并且发现在无骨诱导剂的情况下，生物打印的支架能诱导囊人间充质干细胞向软骨内分化，这说明其有较好的骨诱导作用。

2.2 纳米复合材料生物墨水

纳米复合生物墨水（nanocomposite bioink）是含有纳米颗粒的复合生物墨水。将纳米材料引入会导致许多亲水聚合物牢固的结合在纳米材料的表面，从而纳米复合生物墨水显示出高强度和高韧性［19］。此外，纳米材料的表面提供了蛋白质吸附和焦点黏附位置，从而可以提高蛋白质和细胞在纳米复合生物墨水上的黏附性［20］。纳米复合生物墨水具有剪切减薄性、力学稳定性、导电性、药物可控传递性等优异性能，使得人们对开发和使用纳米复合生物墨水作为组织工程应用的3D 支架越来越感兴趣［21］，当前纳米粘土/纳米硅酸盐、陶瓷纳米颗粒、纳米纤维素、金属纳米颗粒和碳纳米材料等纳米材料已被广泛研究［22］

例如 SAMADI 等［23］制备的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）/琼脂/石墨烯纳米复合水凝胶，石墨烯纳米片上的聚合链通过物理吸附形成的聚合物的网络。研究发现该纳米复合生物墨水具有较好的的力学性能、快速的自愈行为和高效的强度恢复能力。为了生产用于骨组织工程的生物墨水，IM 等［24］使用TEMPO 氧化纤维素纳米纤维（TEMPO-oxidized cellulose nanofibrils,TOCNF）和聚多巴胺纳米颗粒（polydopamine nanoparticles,PDANPs）配制了纳米复合生物墨水。通过载有成骨细胞的支架的体外研究表明，掺入 0.5% PDANP的生物墨水可显著诱导成骨特性。也有研究开发了一种适用于嵌入细菌的 3D 生物打印的基于高度颗粒填充的氧化铝/壳聚糖纳米复合生物墨水，该生物墨水通过与海藻酸盐的静电相互作用和壳聚糖分子与温和的胶凝剂京尼平之间的共价结合得到增强。研究发现将纳米颗粒整合到壳聚糖凝胶中可以显着提高机械阻力和可印刷性，还可以为凝胶增加导电性、抗菌性能等［25］。ZHU 等［26］将胺功能化铜掺杂的玻璃纳米粒子掺入由海藻酸二醛和明胶组成的动态共价交联的生物墨水中，测试发现该墨水具有良好的流变特性、无毒性、形状保真度和结构稳定性。在体外没有额外生长因子的情况下，藻酸盐二醛-明胶-ACuMBGN 支架促进了小鼠原代骨髓基质干细胞的成骨分化和血管生成。

2.3 超分子生物墨水

超分子生物墨水是一类分子通过氢键、π-π 堆积、范德华、静电和疏水作用等非共价键相互作用组装而成的一类材料［27］。超分子生物墨水的组装过程是动态的和可逆的。这些相互作用不同于共价键，当被机械破坏时，它们可以迅速重新形成，而不会对性能造成永久性损失。这比常用的聚合物水凝胶（如海藻酸盐、明胶和胶原）具有许多优点，包括有序和可逆的纳米结构、易于修饰的生物活性行为、可控的降解和对环境刺激的响应性［28］。

尽管超分子生物墨水在分子水平上具有可控的性质，显示出巨大的潜力。然而，它们的机械性能不稳定仍然是3D 生物打印的一大挑战［29］，为此，JIAN 等［30］基于两种末端残基带相反电荷的9-荧甲氧基甲氧基二肽（Fmoc-di 多肽），设计了两种相反电荷的二肽生物墨水，通过两个二肽之间的静电相互作用实现原位凝胶，避免了化学物质、加热、冷却、紫外线照射等交联处理对细胞的损伤。使用基于液滴的3D 打印机构建肿瘤球体。该球体机械性能和可降解性均可在很大范围内调节，使肿瘤球体的形成、生长和自然释放成为可能，并且拓宽了短肽材料在三维生物打印、组织工程、器官再生等领域的应用。由多肽-DNA 水凝胶制备超分子生物墨水有效的克服了非共价水凝胶的形状易变形性、缺乏响应性和可剪切性等缺点［31］，且具有较好的愈合性能和力学性能［32］。DNA 水凝胶包含两个组分：多肽-DNA 偶联物和互补DNA连接物，通过在编程位置交替沉积DNA 偶联物和互补DNA 连接物，可以短时间内构建包含功能性活细胞的3D 结构。测试发现其在生理条件下具有完全可生物降解性。由于物理交联的超分子水凝胶不能满足生物墨水长期保持形状的机械要求［33］。便有人提出二次交联可以解决这个问题。例如HU 等［34］制备了一种由聚乙二醇化壳聚糖、明胶、α-CD 和β-GPS 组成新型的超分子生物墨水，通过双重物理交联获得稳定的生物打印结构，没有有毒副产物或有害成分。生物墨水不仅表现出理想的生物相容性，而且还表现出可调节的强度和较好的机械性能。为构建基于超分子水凝胶的生物墨水提供了一种策略。

2.4 聚合物功能化

为了克服天然聚合物机械强度、热强度、粒径和比表面积差等缺点，研究人员通常对聚合物进行物理和化学改性［35］。许多天然生物油墨（海藻酸盐、壳聚糖、明胶、透明质酸和胶原等）通过功能化来增强其机械强度和稳定性［36］。比如聚合物功能化的一种常用方法是通过甲基丙烯酸酯基团对聚合物主链进行共价交联，最常见的就是甲基丙烯酰胺明胶的合成，甲基丙烯酸酯基团在引发剂的介导下与明胶进行共价交联，形成的聚合物不光的保留了许多基本生物活性，还提高其力学性能［37］。壳聚糖虽然具有生物降解性、生物相容性、无毒、黏附性、无致癌性等优点［38］，但是因其不可控的生物降解性、pH 敏感性低、药物在胃内的释放以及在酸性介质中的溶解性，阻碍了其在药物传递方面的重大发展，通过聚甲基丙烯酸乙二醇酯接枝壳聚糖合成型壳聚糖接枝聚甲基丙烯酸乙二醇酯，不仅提高了多糖的水溶性，而且可以制备出在稀释条件下稳定性良好的颗粒［10］。总之，功能化通过引入共价交联机制来增强生物油墨，这种交联机制比物理交联更强、更稳定。由于交联的快速和永久性质，这些反应越来越受欢迎。功能化技术可以提高水凝胶网络的断裂能，也可以改善网络的均匀性，从而增加延展性。

3 结论和展望

3D 生物打印是组织工程领域应用最广泛的技术之一，生物墨水的选择或设计是3D 生物打印过程中的一个关键步骤，然而，缺乏合适的生物墨水已经成为推动3D 生物打印研究的最大障碍之一。生物墨水需要具有可打印性，并考虑到流变学、溶胀率、表面张力和凝胶动力学等几个参数，相对于传统的单组分水凝胶，互穿网络、纳米复合材料和超分子方法通过使施加的应力能够在不破坏主网络的情况下进行增强生物墨水的性能，聚合物功能化生物墨水通过加强交联键增加固有断裂能。目前使用3D 生物打印设计复杂组织结构的瓶颈是传统生物墨水的有限可用性。最近有不少研究探索了使用多种聚合物生物墨水来打印复杂的组织结构。相信在未来，能够看到用于打印复杂结构的复合生物墨水重大发展。