火龙果汁凉茶的制备品质与生产经济优化

林大成,陆明盈,钟搂,陈美花,王剑峰,颜财发

(1.北部湾大学 a.食品工程学院;b.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室,广西 钦州 535011;2.广西灵山县宇峰保健食品有限公司,广西 灵山 535400;3.广州工商学院 商学院,广州 510800)

现代健康养生观念的兴起,使开发绿色天然果汁饮料具有潜在市场价值.但要取代一般化学勾兑饮料仍有很大的质量改善空间,例如果汁饮料内容物的沉淀稳定[1]、色素保质[2-3]、食源性污染菌[4]及原料成本[5]等四大问题.解决问题的关键在于绿色制备与生态型保质方法.果汁饮料常见内容物的沉淀分层问题涉及均匀乳化性与稳定性[1].对稳定性问题大都关注稳定剂的种类、浓度及添加量,并以离心沉淀率作为判断指标[1],而少有以生物乳化剂作为生态型保质剂.色素保质问题涉及温度与酸碱性对花青素或甜菜苷色素的含量与保留率[2-3],而少有以中药促进生物乳化,强化天然色素的保护作用.食源性污染菌问题涉及中药的活性成分、多酚类物质及多糖等对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度与抑菌圈敏感性[6],而少有结合生物保质剂与低pH发酵的抑菌作用.原料成本问题大都关注原料添加的配方比例与制备条件优化,而少有关注绿色制备方式与生态型保质剂.

火龙果汁凉茶属创新产品,火龙果果肉富含营养、甜菜色素及膳食纤维,具有抗氧化、降低胆固醇、预防便秘等功效.结合养生中药与益生乳酸菌发酵,适合于深加工.本研究旨在火龙果汁饮料产品的保质期限内,解决一般果汁饮料的稳定性、色素保存、污染菌及原料成本等四大问题,为创新产品从生产理论转化成商品提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

火龙果,柠檬(市售),仙草(广西灵山县宇峰保健食品有限公司),中药(山药、枸杞、红曲)(西安百庆生物科技有限公司);混合乳酸菌种(嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌)(山东菌乐生物科技有限公司),苯酚、浓硫酸、三氯乙酸、95%乙醇及葡萄糖等均为分析纯(广州柏研生物科技有限公司).

主要仪器:Evolution 201 &220紫外-可见光分光光度计(上海谱祥科学仪器有限公司);TG16MW台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);AE300L-H台式高速分散均质机(深圳市良谊实验室仪器有限公司);KTNK-80冷冻干燥机(上海乔枫实业有限公司);DG250密封式厌养操作台(上海迪发仪器仪表有限公司).

1.2 实验设计

基于先前研究火龙果汁凉茶最佳配料组合(糖添加量140 g/L,复方中药浓缩液添加量30 mL/L,乳酸菌种添加量100 mL/L及柠檬汁添加量70 mL/L)的结果为基础,再以胞外多糖产量(EPS)为指标,利用单因素分析与正交试验进行筛选火龙果汁凉茶的最佳经济组合为实验组(EX),探讨生产条件的优化参数.同时以仅不添加中药为控制组(CL),仅不添加乳酸菌发酵为对照组(CK)及不添加乳酸菌与中药的火龙果汁为空白组(BK),进行6月加速实验的各项性能评估,包含乳化性、稳定性及抑菌作用等,并测定甜菜苷色素含量与保留率.6月加速实验乃对实验各组在其相同条件下预做相同的6项产品再于每月进行破坏性测定试验.复方中药浓缩液制备工艺为各组分经清洗后50 ℃烘干磨粉的样品,分别称取干粉5.0 g加纯水300 mL熬煮浓缩成200 mL,3种中药浓缩液混合比例为V山药∶V枸杞∶V红曲=1∶1∶1.混合乳酸菌为分别取含量109CFU·L-1的3种菌混合而成,混合比例为V嗜酸乳杆菌∶V德氏乳杆菌保加利亚亚种∶V嗜热链球菌=1∶1∶1.

1.3 单因素试验与正交试验

为考量产品质量与生产经济性,单因素试验主要考察料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、发酵温度(31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃)及发酵时间(8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)等四因素对火龙果汁凉茶中EPS产量的影响,其中以各因素的中间值为固定因素水平.根据单因素试验结果,进行四因素三水平L9(34)的正交优化试验.发酵温度选择一般微生物生长的最佳温度37 ℃为中间值,再各取上下差值为3 ℃以求其差异具有显著性.

1.4 胞外多糖的提取与测定

EPS提取参考文献[7].首先取各试验样品溶液进行抽滤,收集滤液后加入0.4 mol/L的三氯醋酸10 mL,将锥形瓶放入冰箱4 ℃静置3 h后,取体积分数95%酒精以1∶2的料液体积比抽提上清液12 h后,放入冰箱4 ℃静置24 h,以5 000 r/min离心20 min,离心后提取沉淀物,再以分子量6 000～8 000 kD透析膜进行24 h透析,最后收集透析液于冷冻干燥器中进行72 h干燥恒重称量,得粗多糖干质量.胞外多糖测定参考文献[8],采用苯酚硫酸法.首先制备葡萄糖标准曲线,配制葡萄糖标准液(100 mg/L)后稀释5个梯度(5,10,25,50,100 mg/L),以分光光度计在490 nm 测吸光值,在同一波长下测定多糖样品,3个平行取平均值,利用葡萄糖标准曲线计算多糖质量浓度.

1.5 乳化性与稳定性测定

采用乳化指数(E24)法,参考文献[7]的方法稍加修改.配制实验组与控制组各样品EPS溶液,分别以体积比2∶3加入色拉油混合,进行震荡2 min,静止24 h后测量乳化层和总高度,计算乳化指数,

E24=(Eh/EH)×100%,

(1)

式中,E24:乳化指数(%),Eh:乳化层高度(mm),EH:总溶液高度(mm).

稳定性采用离心沉淀法,参考文献[9],测定离心沉淀率并同时计算稳定性.量取各试验组 5 mL 火龙果汁凉茶饮料于10 mL 离心管中,在 3 000 r/min下离心10 min,弃去上清液,称量沉淀质量,计算离心沉淀率,

Sr=(Sm/Ss)×100%,St=100%-Sr,

(2)

式中,Sr:离心沉淀率(%),Sm:沉淀质量,Ss:样品质量,St:稳定性(%).

1.6 甜菜色素的提取测定与保留率确定

根据甜菜苷色素含量作为产品质变的判定指标,甜菜苷色素含量越低表示质变作用越大[3].火龙果汁凉茶中总甜菜色素含量的提取与测定参考文献[2]方法.称取一定量火龙果汁凉茶饮料置于离心管,超声波震荡20 min,以10 000 r/min离心10 min提取红色素并稀释一定倍数,与蒸馏水组进行对照,在535 nm波长下测其吸光值,计算红色素含量,

C=A535×MW×V×DF×(ε×L×W)-1×105mol·cm·g·L-2,

(3)

式中,C:待测样品中甜菜苷质量浓度(g/L),A535:样品在535 nm处的吸光度值,MW:标准甜菜苷摩尔分子质量,550.46 g/mol,V:样品溶液体积(mL),DF:稀释倍数,ε:标准甜菜苷摩尔消光系数,L:试管的透光路径长度(cm),W:原料的鲜质量(g).

将不同处理的火龙果红色素提取液在535 nm波长下测定吸光值,计算色素保留率,

R/%=(A1/A0)×100%

(4)

式中,R:火龙果色素保留率(%),A1:各处理后火龙果红色素提取液在535 nm下的吸光值,A0:新鲜火龙果红色素提取液在535 nm下的吸光值.

1.7 最小抑菌浓度与抑菌圈测定

采用二倍稀释法参考文献[10].首先取火龙果汁凉茶的最佳实验组合(EX)100 mL,EPS为(1 168±120)mg/L,以减压浓缩机进行10倍体积浓缩,得(1 136±180)mg/L,再进行8个梯度的二倍稀释法,稀释后的质量浓度为:(5 680±90)、(2 840±50)、(1 420±230)、(710±11)、(355±6)、(178±3)、(89±1)mg/L.同时做不加菌液的阴性对照,与不加样品的阳性对照.试验菌种包含常见的食品污染菌例如大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli,EL),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA),志贺氏菌(ShigellaCastellani,SC),及沙门氏菌(Salmonella,SM)等.

抑菌圈测定采用琼脂打孔法参考文献[11].首先以NB培养基进行37 ℃,24 h震荡培养四种污染菌,分别吸取适量污染菌液均匀涂抹于培养基.在平板上打孔4个后,其中一孔设置无菌水作阴性对照.将配制一定多糖溶液质量浓度(11.68±0.12)mg/mL并稀释5个梯度的多糖溶液分别加入其余3个孔穴中,静置 3 min,放入37 ℃培养箱培养24 h,用游标卡尺测量抑菌圈直径,同时做对照组与控制组实验如同实验组步骤,平行3次试验,取平均值.本抑菌试验对象包含上述4种食品污染菌.抑菌圈(DI)敏感度参考文献[12]定义为:DI>20 mm为极敏,DI:16～20 mm为高敏,DI:11～15 mm为中敏,DI:5～10 mm为低敏,DI<5 mm为极低敏,DI:0 mm无抑菌圈为不敏感.

1.8 感官评价与产品品质分析

感官评价实验方法参考文献[13].生产发酵后产品品质分析包含微生物与理化指标的测定如乳酸菌数、可溶性固形物含量、pH、固形物含量、总糖、总酸等分别参照文献[14-18].

1.9 生产经济性的计算方法与统计分析

生产经济性的计算方法为以最适化条件对预实验条件或单因素试验的水平条件之差值与最适化条件的百分比,并以影响EPS产量无显著差异的验证条件为依据.

每一试验皆做3重复试验,方差分析利用软件SPSS 26处理,数据分析采用Duncan多重比较在95%或99%水平的统计显著差异.

2 结果与分析

2.1 EPS产量的单因素分析

2.1.1料液体积比对EPS产量的影响

火龙果汁料液体积比对EPS产量的影响如图1(a)所示.随着料液体积比的增加,EPS的产量呈先上升后下降并趋平缓的现象.一般乳酸菌EPS属代谢副产物,通常于稳定期产生[19-20].开始阶段料液体积比1∶1营养丰富,乳酸菌的生长最为旺盛,处于生长对数期,EPS产量最少.当料液体积比1∶3时乳酸菌的生长平稳,EPS产量最高达(1 178±20)mg/L.由于料液体积比1∶5与1∶4的EPS产量(1 038±18)mg/L和(1 056±19)mg/L二者并无显著差异(p>0.5),但显著高于料液体积比1∶2者(987±17)mg/L(P<0.5),因此从成本经济考量,取水平3,4 和 5为佳,以进行正交试验.

2.1.2pH对EPS产量的影响

pH对EPS产量的影响如图1(b)所示,pH值大约与EPS产量呈负相关.随着初始环境pH值的增加,EPS的产量呈先上升后下降的趋势.一般乳酸菌生产EPS的最佳pH在3.5～5.5之间[20].当pH低于4.0时,酸度低抑制乳酸菌的生长,但有利于EPS生产,因此EPS产量相对高于对数生长期[20].当pH高于4.0时,乳酸菌繁殖旺盛处于对数生长期,不利于乳酸菌EPS的生成,因此EPS产量低.当pH为4.0时,乳酸菌的生长最稳定,EPS的产量最高达(1 156±15)mg/L,与其他pH值的产量相比具有显著差异(p<0.05),此时发酵作用最为旺盛,最适合EPS的生产,故最适pH值为4.0.

2.1.3发酵温度对EPS产量的影响

EPS产量随发酵温度升高而呈先上升后下降的趋势(图1(c)).当发酵温度达40 ℃时,乳酸菌的生长最为稳定,EPS产量最高达(1 102±15)mg/L,而一般微生物生长的最佳温度为37 ℃.故除37 ℃外与其他温度的产量相比具有显著差异(p<0.05),因此,最佳EPS产量的温度为40 ℃左右.适当的发酵温度可使中药中活性物质释出,以刺激乳酸菌外源性酶充分分解营养基质,促进EPS产量[21].

2.1.4发酵时间对EPS产量的影响

发酵液中 EPS 的产量随着发酵时间延长而增加后呈稳定的趋势.如图1(d)所示,8～16 h乳酸菌处于快速生长的对数期,于16～20 h后达稳定期,20 h后 EPS产量也达到最高,此时 EPS产量为(1 152±21)mg/L.因此,最适发酵时间约为 20 h,除24 h 外与其他发酵时间的产量相比具有显著差异(p<0.05).充足的发酵时间可使内源性酶充分进行生化反应,以促进乳酸菌发酵作用生产EPS[22].

2.2 EPS产量的正交分析

由单因素分析结果见表1,据此进行四因素三水平的正交优化试验,结果如表2所示.各因素对EPS产量影响的主次顺序由大到小为A(料液体积比),C(发酵温度),B(pH),D(发酵时间),即料液体积比对EPS产量影响最大,其次为发酵温度,再次为pH,发酵时间的影响最小.最优组合为A3B1C1D2,即料液体积比1∶5,pH=4.0,发酵温度37 ℃,发酵时间20 h.适当的料液体积比供应营养,可使乳酸菌生长稳定而不会过度生长繁殖,以最经济的原料产生最大量的EPS.最佳的pH值可抑制乳酸菌过度繁殖使其生长处于稳定期,又可抑制杂菌生长.以较低的发酵温度与适当的发酵时间,可降低乳酸菌发酵的能源消耗,对EPS生产最具经济效益.

表1 火龙果汁凉茶正交试验因素水平

表2 正交试验结果与分析

2.3 结果验证与方差分析

由附表Ⅰ方差分析可知,在不考虑交互作用的情况下,液料体积比、pH、发酵温度及发酵时间对火龙果汁凉茶EPS产量都有极显著的影响(p<0.01),再次验证液料体积比对EPS产量的影响最大,而发酵时间影响最小.由于发酵时间的影响最小,故考虑生产经济性可弹性调整发酵时间范围为16～20 h.故由正交试验得EPS产量的最佳组合为 A3B1C1D2,但因此组合不在正交表上,故进行验证试验,得到产量为(1 178±14)mg/L与最大产量组合(A3B2C1D3)的(1 183±17)mg/L并无显著差异(p>0.05),因此验证可行,即最适生产EPS的经济效益组合为液料体积比1∶5,pH4.0、温度37 ℃及发酵时间20 h.由于发酵时间的影响最小,故再验证A3B1C1D1得EPS产量为(1 168±12)mg/L与最大产量组合(A3B2C1D3)的(1 183±17)mg/L亦并无显著差异(p>0.05),因此验证也可行.故料液体积比可从1∶1调理为1∶5,原料成本可降低5倍;发酵温度可从42 ℃调降至37 ℃,减少5 ℃能源;发酵时间从20 h调降为16 h,可减少4 h生产时间;EPS产量可从(983±10)mg/L提高为(1 168±12)mg/L,增加(18.8±2.4)%,故最适生产EPS的经济效益组合为液料比1∶5、pH4.0、温度37 ℃及发酵时间16 h.总体可提高生产成本的经济性.

2.4 乳化性分析

乳化性可评估产品内容物的分布均匀性,可根据乳化指数(E24)作为产品乳化效果的判定指标,乳化指数越大表示乳化效果越佳,即火龙果汁凉茶饮料的料液均匀分布越佳,且与胞外多糖的产量有关[23].在6月的加速实验中,乳化性分析结果如图2显示,最佳组合的实验组(EX)皆比对照组(CL)与控制组(CK)及空白组(BK)具有较良好的乳化性,各月数值(85.8±0.9)%至(86.5±0.8)%并无显著差异;而仅不添加中药的控制组(CL)与仅不添加乳酸菌的对照组(CK)均无法维持平稳的乳化性,曲线逐渐呈下降趋势,因此唯有二者的协同作用产生足够的胞外多糖以维持乳化稳定; 另外中药里的山药富含黏性蛋白多糖,可增加乳化液黏性,有利于形成具强度的界面膜,可促进与水的亲和力,以维持平稳的乳化性[23-25],故以中药强化乳酸菌可提高胞外多糖产量,增加体系黏度以提高产品的乳化性而维持料液内容物的分布均匀性[25].

2.5 稳定性分析

一般酸性含乳饮料常见沉淀或分层的质量问题.而产品的稳定性可以利用离心沉淀率作为判定的指标.沉淀率与体系的稳定性成反比,离心沉淀率越低稳定效果越佳.在6月的加速实验中,稳定性分析结果如图3显示,最佳组合的实验组(EX)皆比对照组(CL)与控制组(CK)及空白组(BK)具有较良好的稳定性,且各月数值(99.62±0.07)%至(99.67±0.03)%并无显著差异;而仅不添加中药的控制组(CL)与仅不添加乳酸菌的对照组(CK)均无法长久维持良好的稳定性,沉淀率曲线呈逐渐上升趋势,因此唯有二者的协同作用产生较多的胞外多糖,使具有较高的乳化性得以维持良好的稳定效果[24].故中药强化乳酸菌发酵作用可提高胞外多糖产量,以增强产品的稳定性,维持产品内容物不致沉淀分层.与魏然等[9]研究比较,以离心沉淀率考察乳酸菌饮料的最佳稳定性为0.45%,该研究最佳组合的实验组(EX)约为0.33%～0.38%,结果稍优,推论中药促进乳酸菌的协同作用提高胞外多糖产量涉及均质与抽滤等工艺的联合作用.由于饮料颗粒直径越小,沉降速度越小,饮料溶液在乳化体系中越趋稳定[25-26].

2.6 甜菜苷色素含量与保留率分析

火龙果具有丰富的甜菜苷红色素但对光热缺乏稳定性且易受氧化而褪色,因此甜菜苷含量可作为评估产品质变的指标之一.在6月的加速实验中,甜菜苷色素含量分析如图4所示,最佳组合的实验组(EX)皆比对照组(CL)、控制组(CK)及空白组(BK)具有较高且稳定的甜菜苷色素含量(78.8±0.5)～(80.4±0.4)mg/L,各月数值(98.01±0.63)%至(100.25±0.87)%并无显著差异;而仅不添加中药的控制组(CL)与仅不添加乳酸菌的对照组(CK)均无法维持平稳的甜菜苷色素含量,曲线逐渐呈下降趋势,因此唯有二者的共同作用生产足够的胞外多糖,得以维持平稳的甜菜苷色素含量,且能使火龙果汁释放出更多的甜菜苷色素,其保留率在6月后仍可达(98.01%±0.63)%,如图5所示,各月数值并无显著差异,此与文献[3]在低温低酸性环境的保留率(100±10.0)%结果相似,推测该研究与胞外多糖的乳化作用、枸杞多糖与中药多酚类物质的抗氧化护色效果及乳酸菌发酵产生乳酸形成酸性环境有关[2,27].故中药强化乳酸菌可提高胞外多糖产量与总酚含量,以增强产品的甜菜苷色素含量以维持产品的质量.李霞等[2]以加入抗坏血酸促进丙二甜菜苷的转化,而保持甜菜苷含量达成护色效果,与该研究产生胞外多糖的抗氧化效果相同.一般火龙果pH在3.5～5.5时色素最稳定[28],此阶段为乳酸菌胞外多糖高产量的稳定期,而且胞外多糖具有乳化稳定甜菜苷的护色作用[3].因此保持酸性、低温、避光和隔氧可达到防止甜菜苷色素质变的目的[29-30].

2.7 抑菌作用分析

以最佳组合的实验组(EX)进行抑菌作用分析,结果见附表Ⅱ和Ⅲ,最小抑菌质量浓度(MIC)(mg/L)的大小顺序为大肠杆菌(0.355±0.006)mg/L<志贺氏菌(0.710±0.011)mg/L<沙门氏菌(1.42±0.23)mg/L<金黄色葡萄球菌(5.68±0.09)mg/L,此与HEYDARIAN等[31]的研究结果相似.显示抑菌作用以对大肠杆菌(EL)为最强,而对金黄色葡萄球菌(SA)为最弱.对大肠杆菌而言,该研究最小抑菌浓度为MIC:(0.355±0.006)mg/L与阿木古楞等[6]研究结果MIC:31.50 mg/L,比较结果抗性优于后者,与孙长花等[11]研究结果MIC:62.50 mg/L比较也有更优的效果.由于金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌,其细胞壁中肽聚糖壁较革兰氏阴性菌的大肠杆菌为厚,不易为多糖所溶解破坏而表现出较强的抗性,导致具有较大的MIC[31].

抑菌圈由大到小为大肠杆菌(EL),志贺氏菌(SC),沙门氏菌(SM),金黄色葡萄球菌(SA),各菌的抑菌圈与抑菌浓度呈量效关系(R2=0.983 2～0.987 8),抑菌圈随抑菌浓度的增加而增大.从敏感度分析以(11.36±0.18)g/L为基础,大肠杆菌(21.2±0.6)mm属极高敏,志贺氏菌(18.2±0.7)mm与沙门氏菌(15.7±0.8)mm属高敏,金黄色葡萄球菌(10.4±0.5)mm 属中敏.当抑菌质量浓度为(11.36±0.18)g/L时,二者抑制圈分别为(21.2±0.6)mm与(10.4±0.5)mm,前者对后者大约有2倍的抑制效力,此亦与HEYDARIAN等[31]的研究结果相当.与已有研究比较[6,11],该研究结果DI(11.36±0.18)g/L:(21.2±0.6)mm,呈现抑菌浓度小而抑菌圈大的效果.故推论为中药与乳酸菌的协同作用所致[21],表现出良好的抑菌活性,此可能与该研究含有胞外多糖的生物活性成分有关,或与中药促进乳酸菌发酵产生外源性酶增强抑菌活性有关,因为中药中红曲发酵后可产生辅酶Q10,是细胞代谢与细胞呼吸的激活剂[27].另外乳酸菌发酵的作用更能促进柠檬中的有机酸、火龙果中的花青素,酚类等抑菌活性物质的释出,皆能使抑菌效果大为增强,故抑菌作用除胞外多糖外乃前述多种抑菌活性物质的综合效果.

2.8 感官评价与产品品质分析

经济性优化产品发酵后的感官评分结果与原生产发酵条件的最佳配方组合分别为(91.8±1.2)分、(92.5±1.6)分,并无显著差异,因此验证可行.最佳产品品质分析结果显示乳酸菌数量为2.2×1011CFU·L-1、pH为(4.0±0.2)、可溶性固形物含量:(16.3±0.5)%、不溶性固形物含量:(0.36±0.05)%、总糖含量:(14.2±0.8)%、总酸(以醋酸计):(1.28±0.12)mg/L.

3 结 论

最佳实验组(EX)对各组实验(CL、CK、BK)的各项指标:乳化性,稳定性,甜菜苷含量及甜菜苷保留率等分别提升了1.1～1.5倍,27.6～91.6倍,1.4～4.7倍及1.1～1.5倍,而对食源性污染指标菌的大肠杆菌具有最大的抑菌圈与最小的抑菌浓度.在生产经济性方面,结果显示在果汁原料成本,发酵温度能源及发酵时间等分别提高了80%,12%,20%的经济性.

附 录

附表Ⅰ～Ⅲ见电子版(DOI:10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.04.017).

附表Ⅰ 火龙果汁凉茶正交试验的方差分析

附表Ⅱ 最佳实验组对4株菌种的最小抑菌质量浓度

附表Ⅲ 最佳实验组对4株菌种的抑菌圈直径