追风伞中总黄酮的纤维素酶提取工艺优化

胡畔

（贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550000）

追风伞(Lysimachia paridiformis)是报春花科珍珠菜属植物，又名狭叶落地梅。在我国主要分布于四川、云南、贵州、广东、广西、湖南等地，全草可入药，功效有祛风、活血化瘀、定惊、生肌，用于骨折、跌打损伤、小儿惊风、风湿麻木、脚转筋等[1]。黄酮类化合物是广泛存在于各种植物的一类次生代谢产物，是药用植物的主要活性成分之一。黄酮类化合物能够抗菌、消炎、防病毒、抗肿瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化抗氧化和抗微生物、抑制炎症反应的作用[2-6]。但是以纤维素为主的细胞壁把植物中的总黄酮类化合物包围，传统的提取方法没办法使包围黄酮类化合物的细胞壁破裂，黄酮类化合物向溶剂主体的扩散受阻，致使提取效果受限严重，造成严重的资源浪费[7]。

本实验参考了目前的研究经验，并做出了相关的分析与总结，从而使用乙醇法用纤维素酶辅助提取追风伞中的总黄酮，并且在单因素的实验结果的基础上采用正交试验进行提取条件的优化，使得追风伞中总黄酮得到更高效的利用。目前对追风伞的药理作用、化学成分的报道和研究较少。但是对其同属植物的黄酮苷类和三萜皂苷成分的报道和研究较多，而且黄酮苷类具有很好的抗肿瘤作用[8]。经过单因素实验对乙醇体积分数的考察、对料液比的考察、对回流时间的考察以及对回流温度的考察，通过正交试验得出追风伞中总黄酮的最佳提取工艺[9]。刘全德等[10]采取纤维素酶对野马追总黄酮的提取进行辅助，分别控制液料比、酶浓度、酶解温度、酶解时间，并与水煎煮法、乙醇提取法做对比，可借鉴性高。超临界流体萃取法、半仿生提取、酶辅助提取法目前是黄酮类化合物的主要提取方法[11]。超临界流体萃取技术和传统的中药提取分离技术相比，适用范围更广，对原料成分没有破坏，对环境没有污染，具备操作更方便和提取效率更高等一系列优点[12]。但是其成本高，原料不易获取。半仿生提取在一定程度上可以使有效成分更好地溶出，能够缩短生产周期、降低成本，而且对于制剂和使用更有利，但对于单一成分可能不是最佳选择[13]。微波提取法的优点是产率高、能耗低、操作时间短、溶剂用量少等；大量试验结果表明微波提取法可以使黄酮类化合物的提取率大幅度提高，但微波提取法的应用广度很大程度被微波泄漏问题限制，目前微波提取法正处在实验室研究阶段，在热敏性物质领域还是空白，是否能够用于工业化生产还需要更进一步研究[14]。酶解法在天然产物的提取中属于新兴技术，植物细胞壁可以利用酶制剂进行降解，使细胞内有效成分最大限度溶出，与此同时酶制剂可以把植物组织较温和地分解，进一步保证了所提取物质的结构和性质的稳定。追风伞植物的细胞壁主要由半纤维素、纤维素构成，因此实验用酶制剂选用纤维素酶[15]。相对其他有着成本高，对仪器操作要求高等缺点的方法而言，酶解法由于材料易得、成本较低、易操作、无污染、作用明显等特征，可用性更高，因此选择酶解法作为试验方法。

1 实验内容

1.1 实验仪器与试剂

主要仪器（型号）：旋转蒸发器（SENCOR201L）、水浴锅（B-220）、紫外分光光度计（7230G）、循环水式真空泵（SHZ-D）、分析天平（AUY220）、干燥箱（DHG-9070A）。主要试剂：追风伞（安徽省亳州市三义堂药业有限公司提供）、芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供）、纤维素酶（湖南米纯生物科技有限责任公司提供）、乙醇（AR）、NaNO2（AR）、Al(NO3)3（AR）、NaOH（AR）。

1.2 实验步骤

1.2.1 标准曲线的绘制[16]

称取芦丁标准品5.462 mg，加适量50%的乙醇溶液进行溶解，转移至50 mL 容量瓶中，加50%的乙醇定容，配制成浓度为0.1092 mg/mL 的芦丁标准溶液。用移液管准确吸取芦丁标准溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL 分别转移到6 支25 mL 容量瓶中，各加5% NaNO2溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min；加4% NaOH溶液10.00 mL，再加入50%乙醇定容至刻度，摇匀，放置10 min。在510 nm 波长处以试剂空白为参比测定吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y = 12.229x + 0.0081，其线性相关系数为R2= 0.9995。

1.2.2 总黄酮的提取与含量测定

称取一定量预处理好的追风伞粉末置于锥形瓶中，然后称取一定质量的纤维素酶加入，再量取一定体积的50%乙醇加入，在一定温度下提取一段时间后，将提取液过滤，定容，得总黄酮的粗提取液。按“1.2.1”项下方法测定其吸光度，并绘制标准曲线，然后根据标准曲线方程计算浓度，求得提取率。

其中C 是总黄酮提取液中总黄酮浓度（g/mL），V 是总黄酮提取液体积（mL），M 是称取追风伞的质量（g）。

1.2.3 单因素实验

(1)纤维素酶用量对追风伞中总黄酮提取率的影响。称取0.50 g 的追风伞粉末5 份分别置于50 mL 锥形瓶中，控制乙醇体积分数50%，料液比1：20（g/mL），纤维素酶用量分别为0.5 mg、1 mg、1.5 mg、2 mg、3 mg，在40℃条件下反应1.5 h 之后置于70 ℃水浴中灭酶活，5 min 之后过滤，滤液用50%乙醇定容至50 mL，得总黄酮提取液，测定其吸光度并计算总黄酮提取率。

(2)酶解时间对追风伞中总黄酮提取率的影响。称取0.50 g 的追风伞粉末5 份分别置于50 mL 锥形瓶中，控制乙醇体积分数50%，料液比1 ∶20（g/mL），纤维素酶用量1 mg，在40℃条件下分别酶解1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h 之后置于70℃水浴中灭酶活，5 min 之后过滤，滤液用50%乙醇定容至50 mL，得总黄酮提取液，测定其吸光度并计算总黄酮提取率。

(3)酶解温度对追风伞中总黄酮提取率的影响。称取0.50 g 的追风伞粉末5 份分别置于50 mL 锥形瓶中，控制乙醇体积分数50%，料液比1 ∶20（g/mL），纤维素酶用量1 mg，分别在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃条件下酶解2.0 h 之后置于70℃水浴中灭酶活，5 min 之后过滤，滤液用50%乙醇定容至50 mL，得总黄酮提取液，测定其吸光度并计算总黄酮提取率。

(4)料液比对追风伞中总黄酮提取率的影响。称取0.50 g 的追风伞粉末5 份分别置于50 mL 锥形瓶中，控制乙醇体积分数50%，纤维素酶用量1 mg，料液比分别为1 ∶20（g/mL）、1 ∶30（g/mL）、1 ∶35（g/mL）、1 ∶40（g/mL）、1 ∶45（g/mL），在40℃条件下反应1.5 h 之后置于70℃水浴中灭酶活，5 min 之后过滤，滤液用50%乙醇定容至50 mL，得总黄酮提取液，测定其吸光度并计算总黄酮提取率。

(5)乙醇体积分数对追风伞中总黄酮提取率的影响。称取0.50 g 的追风伞粉末5 份分别置于50 mL 锥形瓶中，控制纤维素酶用量1 mg，控制料液比1 ∶20（g/mL），乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%，在40℃条件下反应1.5 h 之后置于70℃水浴中灭酶活，5 min之后过滤，滤液用50%乙醇定容至50 mL，得总黄酮提取液，测定其吸光度并计算总黄酮提取率。

1.2.4 正交试验

在单因素实验基础上，针对纤维素酶对提取率的影响，选取酶解温度、酶解时间、酶用量三个因素进行正交试验。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 纤维素酶用量对追风伞中总黄酮提取率的影响

纤维素酶可使追风伞细胞壁破裂分解，可以提高追风伞中总黄酮的提取率。加入不同质量的纤维素酶时追风伞粉末中总黄酮的提取率结果随加入纤维素酶质量的增加总体呈上升趋势，酶用量少于3.0 mg 时不能使细胞壁完全破解，酶用量为3.0 mg 时总黄酮提取率最高。

2.1.2 酶解时间对追风伞中总黄酮提取率的影响

实验结果表明总黄酮提取率随着酶解时间的增长而呈降低态势。所以并不是酶解时间越长总黄酮的提取率越高，随着酶解时间的增长，提取出的总黄酮物质可能会分解。当酶解为1 h 时提取率最高，超过1 h 后，随着酶解时间的增长，总黄酮类物质分解量逐渐增加。

2.1.3 酶解温度对追风伞中总黄酮提取率的影响

实验结果显示在45℃～65℃之间，总黄酮提取率随温度升高总体呈下降趋势，在45℃时总黄酮提取率最高，在50℃～60℃之间变化较小，随着温度持续升高总黄酮提取率有明显下降，表明在45℃时纤维素酶活性最大，当温度继续升高，纤维素酶逐渐失活。

2.1.4 料液比对追风伞中总黄酮提取率的影响

实验结果能够看出总黄酮的提取率随着料液比中溶剂的增加逐渐降低。随着溶剂的增加，提取出的总黄酮类物质可能会更多地溶解在溶剂中，导致总黄酮提取率降低。在料液比为1 ∶20（g/mL）时总黄酮的提取率最高。

2.1.5 乙醇体积分数对追风伞中总黄酮提取率的影响

根据实验数据能够看出总黄酮提取率先随着乙醇的体积分数升高而升高，之后下降。总黄酮提取率在乙醇的体积分数处于40%～60%区间时呈上升趋势，在60%～80%区间呈下降趋势，在60%的时候总黄酮提取率最高，说明该黄酮类化合物与体积分数60%的乙醇的极性相似。

2.2 正交试验结果与分析

根据正交试验结果，选择反应条件酶解温度50℃，酶解时间1.0 h，纤维素酶用量1.5 mg，此时测得吸光度为0.454，提取率为3.65%，正交实验安排及结果见表2。

表2 正交试验安排及结果

2.3 验证实验

从以上单因素实验和正交试验结果可知得到最佳提取条件工艺为在0.50 g 追风伞粉末中加入1.5 mg 纤维素酶、酶解时间为1.0 h、酶解温度为50℃、液料比1 ∶20（g/mL）、乙醇体积分数60%。在最佳提取条件下进行验证实验，重复进行三次实验，实验结果见表3。

由表3 可知该条件下总黄酮提取率可达3.65%，与在其他条件下的结果相比相对较高，因此该条件为最优实验条件。

3 实验结论

在这项研究中采取纤维素酶辅助提取追风伞中的总黄酮类物质，在单因素的实验结果的基础上进行正交试验，实验得出3 个因素对总黄酮提取率的主次影响顺序为酶解温度＞酶用量＞酶解时间。得到最佳条件下总黄酮提取率可达3.65%，该提取条件为在追风伞粉末中加入纤维素酶1.5 mg、酶解时间为1.0 h、酶解温度为50℃、乙醇体积分数60%，料液比1 ∶20（g/mL）。