蛭龙活血通瘀胶囊与氯吡格雷联用对阿司匹林抵抗大鼠的疗效及机制研究❋

邓谷霖,黄新武,许 红,李秋月,李国春,3△

(1.西南医科大学附属中医医院,四川泸州 646000;2.西南医科大学药学院,四川泸州 646003;3.国家中医临床研究基地建设单位,四川泸州 646000)

阿司匹林是一种非甾体抗炎药,临床也可用于抑制血小板黏附和聚集,降低患者的心肌梗死和中风发生率。但由于其抗血小板聚集疗效因人而异,导致部分患者对其反应不佳,这种情况被称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance,AR)。有文献表明,AR的发生率为0.4%～83%,个体化差异较大[1]。目前,西药治疗AR的效果并不理想,而中药复方制剂具有多靶点、多信号通路的特点,对心脑血管系统栓塞性疾病的预防具有独特优势。基于此,本研究将蛭龙活血通瘀胶囊和氯吡格雷联合使用,通过血栓弹力图(thromboela-stogram,TEG)法和ELISA法观察其对AR大鼠血小板聚集功能、血栓素(thromboxane,TX)B2和6-酮-前列腺素(6-keto-prostaglandin,6-keto-PG)F1α的影响,并通过荧光定量PCR法检测大鼠miRNA-126-3p水平,以探索其可能的作用机制。本研究已通过西南医科大学实验动物伦理委员会批准,编号:2021-0301。

1 材料

1.1 动物

6周龄健康雄性SD大鼠70只,体质量160～200 g,由成都生物制品有限责任公司提供,许可证号:SCXK(川)2013-0028。动物饲养于西南医科大学动物实验中心,采用全新风过滤系统,控制温度20～25 ℃,湿度50%～65%。饲养环境安静无噪声,并采用光照定时装置保持昼夜光变化周期,每周更换2～3次垫料。

1.2 药物

乙酰水杨酸原料药(批号:20200109)与布洛芬原料药(批号:20190505),由武汉贝尔卡药业有限公司提供;硫酸氢氯吡格雷片(批号:Q04201136),规格:75 mg×14片,由石药集团欧意药业公司提供;蛭龙活血通瘀胶囊(批号:20210216),规格:0.4 g×48粒,由西南医科大学附属中医医院制剂室提供。

1.3 主要试剂与仪器

逆转录试剂盒(货号:FSQ-101)、RNA扩增试剂盒(货号:QPK-201),日本TOYOBO公司;大鼠TXB2 ELISA试剂盒(货号:CK302174R)、6-keto-PGF1αELISA试剂盒(货号:CK303044R),泉州睿信公司。

RP 5301型荧光定量PCR仪,北京百泰克公司;TEG 5000型血栓弹力图仪,美国Haemonetics公司;SpectraMax M3型多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司。

2 方法

2.1 分组与造模

70只雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为正常组和造模组,正常组20只,造模组50只。正常组大鼠采用普通饲料喂养12周,造模组大鼠采用高脂高糖高盐饲料(普通饲料70.8%,食用猪油15%,蔗糖10%,食盐4%,胆固醇0.2%)喂养12周[2],并在9～12周时给予原料药乙酰水杨酸(2.7 mg/100 g/d)和布洛芬(3.6 mg/100 g/d)灌胃造模。造模结束后,正常组和造模组各随机挑选10只大鼠,麻醉后取血,经TEG检测显示造模组花生四烯酸诱导的血小板聚集抑制率<50%,表明阿司匹林抵抗大鼠模型造模成功[3]。将造模组剩余的40只大鼠随机分为模型组、蛭龙胶囊组、氯吡格雷组与联合用药组,每组各有10只大鼠。

2.2 给药方法

造模成功后开始给药,蛭龙胶囊组大鼠给予蛭龙活血通瘀胶囊50 mg/100 g/d,氯吡格雷组大鼠给予硫酸氢氯吡格雷片0.7 mg/100 g/d,联合用药组大鼠给予蛭龙活血通瘀胶囊50 mg/100 g/d加硫酸氢氯吡格雷片0.7 mg/100 g/d,正常组和模型组大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,均持续4周。

2.3 取材

第16周给药结束后,所有大鼠以0.2 mL/100 g剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠,麻醉后腹主动脉采血送检。另取部分血液转入冻存管中,立即投入液氮速冷,-80 ℃保存备用。采血后将大鼠脊椎脱臼进行处死。

2.4 TEG检测

每只大鼠取血2 mL于抗凝采血管中立刻送检TEG,采用TEG分析仪及配套试剂检测血小板聚集抑制率[4]。

2.5 ELISA检测

每只大鼠取血1 mL至抗凝采血管,离心后取上层血清,按照ELISA试剂盒说明书检测TXB2和6-keto-PGF1α水平。

2.6 荧光定量PCR检测

每组取8只大鼠血液样本,按照RNA提取试剂盒说明书方法提取RNA,按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。引物合成由上海生工生物工程公司完成,采用茎环法进行引物设计。miRNA-126-3p目的基因:上游引物5’-CGCGTCGTACCGTGAGTAAT-3’,下游引物5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。以U6基因为内参,上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA’,下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达水平。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 TEG检测结果

TEG中的最大幅度指标能反映出血小板聚集功能的高低。与正常组比较,模型组大鼠TEG最大幅度明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,蛭龙胶囊组、氯吡格雷组和联合用药组大鼠TEG最大幅度明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组之间比较,联合用药组大鼠TEG最大幅度降低最明显,干预效果最佳(P<0.05),具体见图1。

注:与正常组比较#P<0.05;与模型组比较*P<0.05;与联合用药组比较△P<0.05;血栓弹力图(TEG)

3.2 ELISA检测结果

与正常组比较,模型组大鼠血清TXB2水平明显升高,6-keto-PGF1α水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,蛭龙胶囊组和联合用药组大鼠血清TXB2水平明显降低,6-keto-PGF1α水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),其中联合用药组大鼠6-keto-PGF1α水平上升更明显,但与氯吡格雷组比较差异未见统计学意义,具体见表1。

表1 各组大鼠血清TXB2和6-keto-PGF1α水平比较

3.3 荧光定量PCR检测结果

与正常组比较,模型组大鼠miRNA-126-3p水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,蛭龙胶囊组、氯吡格雷组和联合用药组大鼠miRNA-126-3p水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);各治疗组之间比较,联合用药组miRNA-126-3p水平上升最明显,干预效果最佳(P<0.05),具体见表2。

表2 各组大鼠miRNA-126-3p水平比较

4 讨论

目前,西药治疗AR的效果并不理想。与西医抗血小板药相比,中药来源广、不良反应小、治疗作用平和,在心脑血管疾病的防治方面具有独特优势[5]。例如陈品良等[6]通过网络药理学分析得出黄芪治疗病毒性心肌炎的核心靶基因有VEGFA、AKT1等,并涉及多个生物学信号通路。赖润民等[7]通过网络分析技术揭示了丹参和红花从凝血过程、炎性反应、代谢调节等多条通路和途径改善AR的作用。AR从中医角度辨证主要为气虚、阴虚、痰湿、血瘀,以心血瘀阻证居多[8]。西南医科大学附属中医医院杨思进教授基于多年的中医临床经验,总结出心血瘀阻证的治疗应以补气为主,破瘀通络为辅,并在此基础上研发了蛭龙活血通瘀胶囊,其组成包括黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等药物。黄芪能补气升阳,具有固表止汗、利水消肿的功效[9];水蛭能破血逐瘀,体内外均具有抗血小板聚集活性的作用[10]。目前该药已广泛用于心脑血管疾病,对AR也有一定的疗效[11]。本研究将蛭龙活血通瘀胶囊与氯吡格雷联合应用对AR大鼠进行干预,观察疗效并探究相应机制,为中西医结合治疗AR提供实验依据。

miRNA是一种小分子调节因子,其参与的转录调控是基因表达的重要环节。有报道显示,一些基因及其相关的非编码RNA的差异表达可导致不同的阿司匹林反应,说明miRNA的异常表达可能也是AR的分子机制之一[12]。血小板含有大量的miRNA,可能通过转录后基因调控在血栓形成和止血中发挥重要作用[13]。有学者认为,若从miRNA及其调控网络的角度出发,探究其在中西药共同作用下受到调控的靶基因在AR患者疾病过程中的抗病机制,可能会对AR的中西医结合治疗带来突破[14]。miR-126是内皮细胞中表达较多的miRNA之一,其中的一条客链miRNA-126-3p在心脑血管疾病中发挥着重要的作用[15]。因此,本实验通过观察药物对各组大鼠miRNA-126-3p的调控作用,尝试从基因角度阐释蛭龙活血通瘀胶囊和氯吡格雷对AR的作用机制。

TXA2作为血小板花生四烯酸的代谢产物,能够使血管收缩,血小板聚集,从而诱发血栓形成。PGI2由花生四烯酸转化而生成,可抑制血小板聚集、对抗血栓形成。TXA2与PGI2在体内属于一对平衡控制体系,能反映出血管壁与血小板的相互作用关系,该平衡一旦被打破可导致血栓等心脑血管疾病,但其性质活泼,在体内不稳定,难以检测。TXB2和6-keto-PGF1α分别是TXA2与PGI2的代谢产物,在体内水平较为稳定,便于检测。有文献表明,AR发生时TXB2水平会增高,而6-keto-PGF1α水平会降低[11]。本次研究结果也显示,与模型组比较,各治疗组大鼠血小板聚集率和TXB2水平降低,6-keto-PGF1α和miRNA-126-3p表达升高,提示大鼠AR有所改善,说明蛭龙活血通瘀胶囊与氯吡格雷均能通过上调miRNA-126-3p水平改善AR大鼠血小板聚集功能,并且联合使用疗效更佳。本研究结果提示miRNA-126-3p可通过降低TXB2、升高6-keto-PGF1α水平来调节血小板聚集率。但是,除了miRNA-126-3p,血小板中还有其他miRNA共同参与基因表达,它们之间的相互作用对AR大鼠血小板的聚集功能可能也会有不同程度的影响,因此仅考察miR-126-3p存在一定局限性,这也是本研究的不足之处。

综上所述,蛭龙活血通瘀胶囊与氯吡格雷能有效降低AR大鼠血小板聚集率,且联合用药改善效果更佳,其机制可能与调控AR大鼠miR-126-3p的表达有关。