全三七片对血管内皮细胞损伤的保护作用研究❋

郭 琰,杨 庆,李 琦,陈 颖,蔡维艳,翁小刚,吴德松,崔 涛,朱兆云△,朱晓新△

(1.云南省药物研究所,昆明 650111;2.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,昆明 650111;3.中国中医科学院中药研究所,北京 100700)

最新的《中国心血管病报告2018》指出,中国心血管疾病患病率处于持续上升阶段[1]。现代研究认为血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)的损伤与多种心血管疾病的发生发展有关,包括高血压、糖尿病、高血脂、缺氧和衰老等。血管内皮细胞是血管内层的一层扁平细胞,对血液和血管壁有分界屏障的作用,同时,血管内皮细胞自身还具有分泌、代谢和免疫等功能,可以分泌血管的舒缩因子,调节机体免疫炎症反应、血流动力学及血管周围器官反应等[2-3]。引起血管内皮损伤的机制主要包括血管活性物质、氧化应激、炎症反应、凝血系统及其他因素等[4]。所以保护血管内皮功能,防止血管内皮损伤是心血管疾病新药研究的方向之一。

三七为五加科人参属植物(PanaxnotoginsengF.H.chen),主产地在云南地区,是云南的道地药材,是我国传统的活血化瘀中药[5]。日常食用三七粉已经成为大众预防心血管疾病的共识。现代研究发现三七具有广泛的心血管保护作用,包括降血压、降血脂、降血糖、抗血小板聚集、保护血管内皮、抑制动脉粥样硬化和改善心肌缺血等[6-7]。目前,三七保护血管内皮功能的研究屡见不鲜,其中报道最多的是三七总皂苷[8],也是三七的主要活性成分,主要来源于三七地下部位(主根)。然而三七其他部位(包括花和茎叶)同样具有较好的心血管活性,却未得到有效的利用,存在药用资源浪费的现象。为充分发掘三七的临床价值,整合三七全株资源,课题组在朱兆云院士的带领下,研发出三七创新药物——全三七片,已获得国家药品监督管理局颁发的临床试验批件和国家发明专利。本文在体外模拟不同因素引起的血管内皮损伤,分别采用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)诱导血管内皮细胞(ECV304)建立血管内皮炎症损伤模型和脂质过氧化损伤模型,探讨全三七片对血管内皮损伤的保护作用,为全三七片的新药开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞株(ECV304),购自湖南丰晖生物科技有限公司。

1.2 药物及制备

全三七片(PSQ)浸膏粉(全三七片的有效活性成分),批号:PSQ-20190826,由云南省药物研究所天然药物化学研究室提供。制备工艺如下:将三七花、三七茎叶和三七(含剪口、荆条和主根,药材由云南省药物研究所天然药物资源研究室正高级工程师苏钛鉴定并确认)按比例混合,乙醇回流提取,提取液过大孔吸附树脂柱(用水、乙醇溶液洗脱),将水洗脱液浓缩后的醇沉部分和乙醇洗脱浓缩液合并,减压干燥,粉碎即得。PSQ浸膏粉中含有30%左右的三七皂苷、10%左右的三七多糖和1%左右的三七总黄酮。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM高糖培养基,美国Gibco公司(批号8120117和8119348);胎牛血清,赛澳美细胞技术(北京)有限公司(批号20180515);青链霉素、胰蛋白酶EDTA消化液,索莱宝公司(批号20200609和20200317);磷酸盐缓冲液PBS,美国Hyclone公司(批号AE29042298);丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒、一氧化氮(Nitric oxide, NO)试剂盒、总一氧化氮合成酶(total nitric oxide synthase, T-NOS)试剂盒,南京建成生物工程研究所(批号20200707、20200713、20200703、20200704、20200628和20200724);白介素(interleukin, IL)-6 ELISA试剂盒,武汉基因美科技有限公司(批号CR2020-06);IL-1βELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒,深圳达科为生物技术有限公司(批号2007-2和1912-1);内皮素(endothelin,ET)-1 ELISA试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司(批号5911649727);ox-LDL,北京协生生物科技有限责任公司(批号20200615);吲哚美辛,中国食品药品检定研究院(批号100258-200904);维生素C注射液,国药集团容生制药有限公司(批号20191205)。

SpectraMax Plus384型连续波长酶标仪,美国MD公司;HZQ-100型恒温培养箱,太仓市实验设备厂;SORVALL Legend RT型离心机,美国Thermo Scientific公司。

1.4 ECV304细胞的培养方法

ECV304细胞采用10%胎牛血清的DMEM完全培养基,按照细胞常规培养方法进行细胞的复苏和传代,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中贴壁培养。

1.5 TNF-α诱导ECV304细胞炎症损伤模型的建立

1.5.1 细胞分组 取对数生长期ECV304细胞消化计数,以1×105/mL的细胞密度接种于12孔板中,每孔1 mL,待细胞贴壁后进行细胞分组,将细胞分为7组,每组6个复孔,分别为正常对照组,模型对照组(TNF-α),PSQ浸膏粉25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL组以及吲哚美辛组(0.2 μg/mL)。正常对照组不造模,其余各组均使用TNF-α50 ng/mL干预24 h,药物干预组同时加入相应的药物。药物处理24 h后,获取上清,离心分装处理后,用于进行相关指标的测定。

1.5.2 指标检测 造模及药物干预24 h后吸取细胞上清液,使用低速离心(2350 g,5 min)去除细胞上清液中的悬浮细胞和大颗粒物质,进而使用高速离心(13500 g,5 min)去除样本上清液中的细颗粒杂质。进行内皮细胞功能检测(ET-1、NO),氧化应激指标检测(MDA、SOD)和炎症因子检测(IL-6、IL-1β),按试剂盒说明书进行操作。

1.6 ox-LDL诱导ECV304细胞脂质过氧化损伤模型的建立

1.6.1 细胞分组 取对数生长期细胞消化计数,以1×105/mL的细胞密度接种于12孔板中,每孔1 mL,37 ℃,5% CO2进行培养,培养8 h待细胞贴壁牢固,将细胞分为6组,每组4个复孔,分别为正常对照组、模型对照组(ox-LDL)、PSQ浸膏粉50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL组以及维生素C组(50 μg/mL)。正常对照组不造模,其余各组去除培养基,用无血清培养基饥饿18 h后,模型对照组使用ox-LDL(50 μg/mL)干预24 h,药物组同时加药物干预,药物处理24 h后,获取上清,离心分装处理后,用于进行相关指标的测定。

1.6.2 指标检测 吸取培养上清,首先使用低速离心(2350 g,5 min)去除细胞上清液中的悬浮细胞和大颗粒物质,进而使用高速离心(13500 g,5 min)去除样本上清液中的细颗粒杂质。继而将离心处理后的上清进行NO、TNOS、MDA、SOD、IL-1β、ET-1和TNF-α含量的检测。整个检测过程严格按试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 PSQ浸膏粉对TNF-α诱导ECV304细胞炎症损伤模型的影响

2.1.1 PSQ浸膏粉对TNF-α诱导ECV304细胞内皮功能的影响 图1示,TNF-α造模24 h后,与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中的ET-1含量和总NO漏出量显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,PSQ浸膏粉100 μg/mL和200 μg/mL浓度组细胞上清液中的ET-1含量显著降低(P<0.05),200 μg/mL浓度组细胞上清液中的总NO漏出量显著降低(P<0.05)。

注:与正常对照组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;内皮素(ET-1),一氧化氮(NO)A.PSQ对ET-1的影响;B.PSQ对NO的影响

2.1.2 PSQ浸膏粉对TNF-α诱导ECV304细胞氧化应激水平的影响 图2示,TNF-α造模24 h后,与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中的总MDA漏出量显著升高(P<0.01),总SOD漏出量显著降低(P<0.05);与模型对照组比较,PSQ浸膏粉200 μg/mL组细胞上清液中的总MDA漏出量显著降低(P<0.01),总SOD漏出量显著升高(P<0.01)。

注:与正常对照组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型对照组比较**P<0.01;丙二醛(malondialdehyde, MDA),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)A.PSQ对MDA的影响;B.PSQ对SOD的影响

2.1.3 PSQ浸膏粉对TNF-α诱导ECV304细胞炎症因子水平的影响 图3示,TNF-α造模24 h后,与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中的IL-1β和IL-6含量均显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,PSQ浸膏粉50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL浓度组细胞上清液中的IL-1β含量显著降低(P<0.05),100 μg/mL和200 μg/mL浓度组细胞上清液中的IL-6含量显著降低(P<0.01)。

注:与正常对照组比较##P<0.01;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;白介素1-β(IL-1β),白介素-6(IL-6)A.PSQ对IL-1β的影响;B.PSQ对IL-6的影响

2.2 PSQ浸膏粉对ox-LDL诱导ECV304细胞脂质过氧化损伤模型的影响

2.2.1 PSQ浸膏粉对ox-LDL诱导ECV304细胞内皮功能的影响 图4示,ox-LDL造模24 h后,与正常对照组比较,模型对照组细胞上清中的ET-1含量显著上升(P<0.01);与模型对照组比较,PSQ浸膏粉200 μg/mL组细胞上清液中的NO含量及TNOS活力显著降低(P<0.05或P<0.01),PSQ浸膏粉50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL细胞上清中ET-1含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。

注:与正常对照组比较##P<0.01;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;一氧化氮(NO),总一氧化氮合成酶(T-NOS),内皮素(ET-1)A.PSQ对NO的影响;B.PSQ对T-NOS的影响;C.PSQ对ET-1的影响

2.2.2 PSQ浸膏粉对ox-LDL诱导ECV304细胞氧化应激水平的影响 图5示,ox-LDL造模24 h后,与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中的MDA含量显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,PSQ浸膏粉50 μg/mL和100 μg/mL组细胞上清液中的MDA含量显著降低(P<0.05),SOD活力显著升高(P<0.05)。

注:与正常对照组比较##P<0.01;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)A.PSQ对MDA的影响;B.PSQ对SOD的影响

2.2.3 PSQ浸膏粉对ox-LDL诱导ECV304细胞炎症因子水平的影响 图6示,ox-LDL造模24 h后,与正常对照组比较,模型对照组细胞上清中的IL-1β、TNF-α含量明显上升(P<0.01);与模型对照组比较,PSQ浸膏粉50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL细胞上清中TNF-α含量显著降低(P<0.05)。PSQ浸膏粉200 μg/mL细胞上清中IL-1β的含量显著降低(P<0.05)。

注:与正常对照组比较##P<0.01;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;白介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)A.PSQ对IL-1β的影响;B.PSQ对TNF-α的影响

3 讨论

血管内皮细胞作为一种动态调节的细胞,其功能状态在氧自由基产生、局部血管舒缩和维持血管稳态平衡中起关键作用[9]。动脉粥样硬化被认为是心血管疾病共同的病理基础,而血管内皮细胞的功能紊乱是导致动脉粥样硬化的前期病变因素[10-11]。因此,维持血管内皮细胞功能的稳态,对预防和治疗动脉粥样硬化性心血管疾病具有重要意义[12]。在临床上可以通过检测内皮依赖性的血管舒缩介质和内皮细胞的完整性等来评价血管的内皮功能,进而预测动脉粥样硬化的发生发展[13-14]。

目前针对血管内皮损伤机制的研究主要集中在血管活性介质、氧化应激、炎症反应、血流动力学、血管老化和凝血反应等[15]。血管内皮细胞自身可以表达多种血管活性物质,调节血管的生理功能, ET是目前已知最强的内源性血管收缩剂[16],而NO为内皮源型舒张因子[17],体内的ET/NO系统处于一种动态平衡状态,维持血管舒张和收缩平衡,调节血管张力。ROS是血管内皮损伤进程中的关键信号分子[18],ROS作用于血管内皮细胞的基底膜,降低SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶活性,损伤机体的抗氧化作用,同时引发脂质过氧化作用,使血管内皮细胞的通透性增加,有利于ox-LDL浸润至内皮细胞下层,导致动脉粥硬化的发生发展[19-20]。此外,血管内皮改变、氧化应激反应及ox-LDL的浸润都可以使炎症细胞穿过血管壁屏障,进一步导致血管内皮细胞损伤脱落,内皮细胞还可以激活经典的NF-κB信号通路,调控细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6),增加内皮细胞和白细胞等炎症细胞的相互作用,进而增加动脉粥样硬化的炎症反应[21]。在本文中,结合血管内皮细胞损伤机制,我们选择了TNF-α和ox-LDL作为诱导剂,在体外建立血管内皮细胞损伤模型。

在本研究中,通过TNF-α和ox-LDL诱导,成功建立不同原因所致的血管内皮细胞ECV304损伤模型,全三七片的有效活性成分PSQ干预后,可以显著改善血管内皮细胞ECV304的损伤,包括抑制血管活性物质(ET),改善氧化应激水平(MDA和SOD),降低炎症反应(TNF-α、IL-1β、IL-6)。但在对NO的影响方面和预期结果不符。文献报道,NO作为血管舒张因子,在血管内皮细胞损伤时呈现下调的状态[22]。而在本研究中,TNF-α可以显著升高NO含量,ox-LDL亦有升高的趋势。通过文献查阅发现,在炎症条件下,血管细胞可以表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),其产生大量的NO导致血管功能障碍,促进氧化/氮化应激,可见,生理情况下产生的NO具有抗动脉粥样硬化的作用,而病理状态下生成的NO可能引发和加速动脉粥样硬化,这也是NO的双向调节作用[23-24]。因此,在本文的体外研究中,过多的炎症刺激导致NO含量提高,而PSQ具有显著的抗炎作用而抑制了NO的生成。

三七作为我国的传统中药,研究报道颇多,在血管内皮细胞保护方面的研究也是屡见不鲜,大多集中于三七总皂苷或其主要皂苷成分[25]。而三七其他部位(三七茎叶和三七花)在血管内皮保护方面的研究较少。一直以来,在三七报道的药理活性中,不同部位呈现的主要功效亦不同,三七(主根)药理活性集中在活血化瘀方面[26],而三七茎叶和三七花药理活性主要集中在镇静安神[27]和降压作用[28]。而在药物研究方面,三七资源的利用更是主要局限于地下部分,其他部位的药效并未充分发掘其临床价值。而课题组在前期工作中发现,三七其他部位同样具有较好的心血管药理活性。本文中的全三七片创新性地整合了三七全株资源,将三七、三七茎叶和三七花按一定比例配伍,在中医配伍理论方面,以三七(剪口、筋条和主根)为君,取其散瘀、定痛、补虚之功,其主根性温味甘,活血散瘀兼有补虚强壮、扶正固本之效;以三七茎叶为臣,取其活血、养血安神之效,其味辛,发散结滞,通脉活血,滋养心脉,神得安;以三七花为佐,取其清热、生津之效,以应对长期服用三七的温燥之虞,取其平肝降压之效,其质轻,引药上行,以解上焦、神志之症。以上药味合用,可以更好地发挥三七活血散瘀之功效。而本文同样发现,增加了三七茎叶和三七花的全三七片在血管内皮细胞保护方面同样具有显著的药理活性。后续将结合本文的研究结果,进一步从调控炎症和氧化应激的角度探讨全三七片保护血管内皮细胞损伤的作用机制[29-30]。

综上所述,三七创新新药全三七片对血管内皮细胞损伤具有较好的保护作用,主要通过抑制血管活性物质,改善氧化应激水平和降低炎症反应来实现。全三七片新药的开发可以更好地利用三七全株资源,促进三七产业的发展,还可以更好地提高三七临床应用的价值。