LncRNA RMRP对LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

邓李玲

齐齐哈尔医学院附属第三医院儿科，黑龙江齐齐哈尔 161000

急性肺炎是一种主要影响肺部的急性下呼吸道感染。临床表现症状重、并发症多，严重者可危及患儿生命[1-3]。许多最常见病原体抗生素耐药性的日益流行使这一挑战变得更加困难[4-6]。因此，探索更加安全、有效的治疗方法成为临床上亟待解决的问题。长链非编码RNA（lncRNA）是最近发现的一种重要的RNA转录物，没有蛋白质编码潜力。但以顺式或反式介导基因表达发挥多种生物功能[7-8]，但lncRNA作为内皮细胞对急性肺损伤应答的潜在参与者的调控作用尚未得到详细研究。RMRP是RNase MRP复合物的一部分。研究证实RMRP可通过调控TGFβ/Smand信号，而该信号通路在急性肺损伤纤维化的发生、发展中具有重要作用[9-10]，基于此，本实验采用LPS处理肺上皮细胞模拟急性肺损伤探究LncRNA RMRP对肺上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响，为探究LncRNA RMRP作用机制奠定基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肺泡上皮细胞BEAS-2B购自上海ATCC细胞库，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、阳离子脂质体2000均购自GIBCO公司，载体均购自金斯瑞公司。CCK-8试剂购自DOJINDO，白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒均购自武汉伊艾博科技有限公司，细胞周期特异性凋亡试剂盒购自BD公司，Trizol试剂及逆转录试剂盒购自invitrogen公司，抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

使用完全培养基（DMEM+10%FBS）培养BEAS-2B细胞，以2×105个/mL密度接种24孔板中，37℃，5%CO2，1 h后用50 μg/mL的LPS处理，命名为LPS组，24 h后收集细胞待用。取对数生长期的BEAS-2B细胞，以2×105个/mL密度接种24孔板中，参照Lipofectamine 2000试剂说明书将干扰RMRP的载体sh-RMRP及其对照载体Si-CON分别染至BEAS-2B细胞，48 h后分别以50 μg/mL LPS处理，分别命名为LPS+Si-RMRP组和LPS+Si-CON组，以空白细胞作为对照组，每组设置9个复孔，24 h后收集待用。

1.3 观察指标

①LncRNA RMRP的表达：提取细胞总RNA，逆转录cDNA并作为PCR的模板，以荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，计算LncRNA RMRP的相对量。②细胞增殖率及凋亡率：CCK-8检测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡率。③炎症因子：按照ELISA检测试剂盒说明书检测IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平。④蛋白表达：Western blot 检测Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理，符合正态分布的计量资料用（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS组与对照组肺泡上皮细胞中的LncRNA RMRP及炎性因子表达比较

与对照组相比，LPS组BEAS-2B细胞中LncRNA RMRP、IL-1β、IL-6、TNF-α及凋亡率的表达量显著升高，细胞存活率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相对表达量显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达

表1 LPS组与对照组肺泡上皮细胞中的LncRNA RMRP及炎性因子表达比较(±s)

组别对照组（n=9）LPS组（n=9）t值P值RMRP表达量1.01±0.12 4.05±0.27 30.867＜0.001 IL-1β（ng/L）55.87±4.32 186.38±12.14 30.385＜0.001 IL-6（ng/L）114.45±10.01 334.29±19.56 30.016＜0.001 TNF-α（ng/L）128.89±11.17 358.40±20.76 29.207＜0.001细胞凋亡率（×10-2）5.13±0.48 11.69±1.59 11.849＜0.001细胞存活率（×10-2）100.47±3.87 81.06±4.45 9.874＜0.001

2.2 沉默表达LncRNA RMRP对LPS诱导的肺泡上皮细胞的影响

与LPS+Si-CON组相比，LPS+Si-RMRP组肺上皮细胞中RMRP表达、炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平及细胞凋亡率显著降低，细胞存活率显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

表2 沉默表达LncRNA RMRP对LPS诱导的肺泡上皮细胞的影响(±s)

表2 沉默表达LncRNA RMRP对LPS诱导的肺泡上皮细胞的影响(±s)

组别LPS+Si-RMRP（n=9）LPS+Si-CON（n=9）t值P值RMRP表达量0.89±0.06 4.02±0.19 47.127＜0.001 IL-1β（ng/L）69.63±4.81 189.45±11.59 30.385＜0.001 IL-6（ng/L）121.14±10.85 328.22±18.76 30.016＜0.001 TNF-α（ng/L）142.56±11.39 362.31±21.04 29.207＜0.001细胞凋亡率（×10-2）7.21±0.65 12.14±1.48 11.849＜0.001细胞存活率（×10-2）92.58±3.47 80.55±4.51 9.874＜0.001

3 讨论

急性肺炎是指由肺源性各种致病因子引起的单肺或双肺组织发炎，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，进而导致的急性呼吸功能不全[11-13]。RMRP是第一个被发现由细胞核合成再定向转运至线粒体的RNA分子，已有研究发现LncRNA RMRP可以减轻LPS诱导的急性肾损伤[14-16]，研究中发现LPS刺激增加了HK-2细胞中RMRP的表达。转染干扰RMRP表达的载体显著降低LPS诱导的HK-2细胞中的RMRP水平。在功能上，流式细胞术分析表明，LPS 处理后细胞凋亡率增加，并且RMRP的敲低逆转了LPS对细胞凋亡的影响。Western印迹结果显示LPS诱导的Bax表达增加和Bcl-2表达减少被HK-2细胞中RMRP的敲低抵消了。最后，ELISA表明LPS刺激增加了TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，并且通过敲低RMRP恢复了这些结果。这些发现表明，RMRP的敲低可抑制脓毒症诱导的急性肾损伤体外模型中的细胞凋亡和炎症因子的产生。但尚未有文献报道LncRNA RMRP是否参与急性肺炎的发生和发展过程[17-18]，因此，本研究以LPS诱导肺泡上皮细胞BEAS-2B模拟急性肺炎，探讨LncRNA RMRP对LPS诱导的肺泡上皮细胞BEAS-2B凋亡、炎性反应的作用，结果显示，与对照组相比，LPS诱导的肺泡上皮细胞RMRP、BEAS-2B的IL-1β、IL-6、TNF-α凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白显著升高（P＜0.05），细胞存活率、Bcl-2蛋白显著降低（P＜0.05），可见LPS诱导肺泡上皮细胞损伤模型建立成功，采用脂质体转染法将干扰RMRP表达载体转染至LPS诱导的肺泡上皮细胞BEAS-2B，结果显示，LncRNA RMRP沉默表达RMRP的表达量（0.89±0.06），显著低于LPS+Si-CON组的（4.02±0.19）（P＜0.05），RMRP低表达可以显著抑制肺泡上皮细胞凋亡，降低炎性因子水平，促进细胞增殖。

综上所述，LncRNA RMRP在急性肺炎的发生和发展过程发挥重要作用，有望成为急性肺炎新的治疗靶点。