药物保留灌肠对放射性直肠炎大鼠的药效学研究*

李雅菲，汪代杰，张 燕，文庆莲

（1．泸州市人民医院，四川 泸州 646000；2．西南医科大学附属医院，四川 泸州 646000）

放射性直肠炎通常发生于盆腔恶性肿瘤患者放疗中或放疗后，是一种直肠并发症，严重降低患者的生活质量[1]。直肠黏膜及血管结缔组织在受到放射线的损伤后，可在一定程度上抑制肠黏膜上皮细胞的增殖，且细胞出现充血、水肿等现象，进而导致疼痛、排便困难等症状[2-3]。随着放疗技术的不断提高，放射性直肠炎的发病率也随之升高，故对该病的研究也逐渐深入。目前常用于治疗放射性直肠炎的药物有肠黏膜保护剂、抗炎类药物、调节肠道菌群类药物等[4-6]。近年来，关于放射性直肠炎的治疗取得了很大的进展，其中比较有意义的治疗方案为药物保留灌肠[7]。研究表明，消痔灵、谷氨酰胺、美沙拉嗪、庆大霉素的中西药结合联合灌肠液在防治放射性直肠炎方面有很好的疗效[8]。本研究拟通过在药物保留灌肠防治大鼠放射性直肠炎的基础上，对保留灌肠药物的药效学进行探究，通过对大鼠一般体征、病理评分、血常规、生化指标及血清中炎症因子等指标进行评估分析，对药物保留灌肠的有效性进行印证，同时对药物的最佳剂量进行探寻，并为以后更进一步的探究奠定基础。

1 材 料

1.1 实验动物 50只SPF级6～8周健康雌性SD大鼠（200～220g），购自西南医科大学动物中心，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-17。实验开始前在西南医科大学附属医院肿瘤科实验动物房适应性喂养1周，常规进食、饮水。实验室温度为（22±3）℃，湿度为（55±10）%，12 h/12 h光暗交替。本研究已获得西南医科大学附属医院伦理委员会的批准（批号：H20210326）。

1.2 药物与试剂 消痔灵注射液（批号：170623）购自集安益盛药业股份有限公司；硫酸庆大霉素注射液（批号：180306）购自容生制药有限公司；谷氨酰胺胶囊（批号：171019）购自神华药业有限公司；美沙拉嗪肠溶片（批号：180915）购自佳木斯鹿灵制药有限公司。0.9%氯化钠注射液、10%福尔马林固定液由西南医科大学肿瘤科和病理科提供。HE染色液（批号：171108）购自江苏绿叶生物科技有限公司。白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（批号：180326）、IL-8 ELISA试剂盒（批号：171203）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（批号：180521）均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 ProCyte DxR全自动血细胞分析仪、Catalyst OneR全自动生化分析仪（美国IDEXX）；BX53光学显微镜（日本OLYMPUS）；HS-S7120-A型切片机、HS-B7126-A型石蜡包埋机（沈阳恒松科技有限公司）；CHT210R离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Multiskan GO酶标仪（上海巴玖实业有限公司）。

2 方 法

2.1 分组与造模 将50只健康雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。除对照组外，其余大鼠用戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，仰卧位固定，选用6 MV-X射线，照射剂量为25 Gy（400 cGy/min），照射范围自耻骨联合至肛门，照射野面积约3 cm×4 cm，源皮距100 cm，根据实验相关要求构建大鼠放射性直肠炎模型[8]。若大鼠存在腹泻、黏液脓血便等症状，并且出现直肠病理改变即表示造模成功[9]。

2.2 实验给药 造模成功后灌肠14 d，1次/d，在同一时间段灌肠。为保证药物充分吸收，灌肠前排空大鼠大小便。将大鼠麻醉后固定，使用注射器将灌肠液通过小儿导尿管插进大鼠肛门（提前润滑）内约3 cm处，匀速将溶液推入后将导管退出，在原位保持20 min。对照组、模型组大鼠灌肠0.9%氯化钠注射液1.5 mL；低剂量组（按照人与动物体表面积进行等效折算[8，10]，临床等效药量的1倍）大鼠灌肠1.5 mL混合液[消痔灵（24 mg/kg）、谷氨酰胺胶囊（300 mg/kg）、美沙拉嗪肠溶片（90 mg/kg）和庆大霉素（0.96万IU/kg）]；中剂量组（临床等效药量的2倍）大鼠灌肠1.5mL混合液[消痔灵（48mg/kg）、谷氨酰胺胶囊（600mg/kg）、美沙拉嗪肠溶片（180 mg/kg）和庆大霉素（1.92万IU/kg）]；高剂量组（临床等效药量的4倍）大鼠灌肠1.5 mL混合液[消痔灵（96 mg/kg）、谷氨酰胺胶囊（1 200 mg/kg）、美沙拉嗪肠溶片（360 mg/kg）和庆大霉素（3.84万IU/kg）]。

2.3 观察指标

2.3.1 一般体征评分 每日观察大鼠的进食、饮水量、排便、自由活动等一般体征，并进行评分。评分标准[11]如下。1分：大便成形，肛门皮肤无损，饮食和饮水正常，体质量无减轻，活动正常，毛发光滑干净；2分：大便不成形、黏液状，肛周皮肤脱毛部位直径＜0.5 cm，饮食和饮水量略有减少，体质量减轻1～2 g，活动减少，毛发顺滑度稍差；3分：腹泻，黏液便血，肛周皮肤脱毛部直径0.5～1.0 cm，饮食和饮水量明显减少，体质量减轻2～3 g，偶尔蜷缩，活动少，毛发顺滑度明显变差；4分：腹泻、水样便和（或）黏液过多，肛周皮肤脱毛部位直径＞1.0 cm，拒水拒食，体质量减轻＞3 g，蜷缩少动，有弯腰扭动现象，毛发失去光泽度。

2.3.2 大鼠直肠组织病理学 各组大鼠药物保留灌肠14 d后以脱颈椎的方式处死大鼠，取其直肠组织并沿纵轴方向剪开直肠置于10%福尔马林固定液中固定。将固定后的组织用石蜡包埋，切片，通过HE染色液对其染色，采用光学显微镜观察组织病理学变化情况。

2.3.3 直肠病理状态分级 根据大鼠放射性直肠炎病理状态进行分级[12-14]，并计算直肠病理损伤评分。0级：直肠黏膜正常，计0分；1级：非常轻微的损伤，非常轻微的直肠炎症和（或）非常轻微的直肠腺体损伤，计1分；2级：损伤较轻，直肠炎症或腺体改变较1级更明显，计2分；3级：中度损伤，直肠上皮脱落明显，计3分；4级：严重损伤，出现溃烂或坏死，计4分。

2.3.4 血常规和血生化指标 各组大鼠药物保留灌肠处理14 d后，颈动脉取血，使用全自动血细胞分析仪测定大鼠白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、红细胞压积（HCT）和平均血小板体积（MPV）；使用全自动生化分析仪测定血生化指标血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总蛋白（T-PROT）、白蛋白（ALB）。

2.3.5 血清炎症因子水平 采集大鼠颈动脉血液样本静置，析出血清后，在4 ℃下以3 000 r/min的转速离心15 min，收集血清，使用ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量。

2.4 统计学方法 应用SPSS 22.0软件分析数据，通过Kolmogorov-Smirnov检验和Levene检验进行正态性、方差齐性检验，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较使用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠一般体征评分比较 对照组大鼠精神良好，较活跃，饮食、饮水正常，体质量平稳增加，毛色有光泽。模型组大鼠食物消耗和水摄入量降低，体质量减轻；喜静，反应迟钝，皮毛光泽度变差；出现非正常排便，如稀便、黏液便、大便出血等。低、中、高剂量组大鼠一般体征得到明显改善。

模型组大鼠一般体征评分高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量组大鼠一般体征评分均低于模型组（P＜0.05）；中、高剂量组大鼠一般体征评分均低于低剂量组（P＜0.05）；高剂量组大鼠一般体征评分低于中剂量组（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠一般体征评分比较 （±s）

表1 各组大鼠一般体征评分比较 （±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别 n 一般体征评分/分对照组 10 0.00±0.00模型组 10 3.29±0.25a低剂量组 10 1.57±0.16b中剂量组 10 0.64±0.07b c高剂量组 10 0.27±0.03b c d F 946.874 P 0.000

3.2 各组大鼠直肠病理损伤评分比较 对照组大鼠肠上皮细胞排列整齐，肠绒毛清晰可见，未见明显损伤。模型组大鼠直肠黏膜隐窝出现扩张或者其结构消失；黏膜中杯状细胞数量减少，黏膜出现坏死，组织上皮存在萎缩现象，组织中腺体受到严重损伤，溃疡发生，大量中性粒细胞浸润于黏膜及黏膜下，部分出现充血、水肿严重等现象。低、中、高剂量组大鼠直肠病理特征得到改善，病理分级均低于模型组。（见图1）

图1 各组大鼠直肠组织病理染色代表性图片 （HE，×400）

模型组大鼠直肠组织病理损伤评分高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量组大鼠直肠病理损伤评分均低于模型组（P＜0.05）；中、高剂量组大鼠直肠病理损伤评分低于低剂量组（P＜0.05）；高剂量组大鼠直肠病理损伤评分低于中剂量组（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠直肠组织病理损伤评分比较 （±s）

表2 各组大鼠直肠组织病理损伤评分比较 （±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别 n 直肠病理损伤评分/分对照组 10 0.00±0.00模型组 10 2.89±0.17a低剂量组 10 1.64±0.18b中剂量组 10 0.54±0.07b c高剂量组 10 0.27±0.03b c d F 1 062.422 P 0.000

3.3 各组大鼠血常规检测结果比较 模型组大鼠WBC低于对照组（P＜0.05），RBC、HGB、HCT均高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量组大鼠WBC高于模型组，RBC、HGB、HCT低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量组大鼠WBC均高于低剂量组（P＜0.05），RBC、HGB、HCT均低于低剂量组（P＜0.05）；高剂量组大鼠WBC高于中剂量组，RBC、HGB、HCT均低于中剂量组（P＜0.05）。各组大鼠PLT与MPV比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血常规检测结果比较 （±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别 n WBC/（109/L） RBC/（1012/L） HGB/（g/L） PLT/（109/L） HCT/% MPV/FL对照组 10 8.37±0.87 9.45±0.67 156.46±6.25 1 366.25±114.31 42.20±3.65 6.12±0.87模型组 10 2.59±0.42a 18.98±1.37a 243.32±10.08a 1 350.26±112.39 89.63±4.02a 6.28±0.67低剂量组 10 4.29±0.58b 15.28±0.86b 201.76±8.65b 1 346.82±120.28 70.15±5.34b 6.45±0.60中剂量组 10 6.12±0.59b c 12.02±0.59b c 185.79±8.03b c 1 355.67±102.54 56.23±3.24b c 6.12±0.57高剂量组 10 7.58±0.64b c d 10.10±0.68b c d 161.32±8.12b c d 1 369.24±119.28 47.12±3.54b c d 6.23±0.68 F 138.474 202.514 178.739 0.074 227.118 0.396 P 0.000 0.000 0.000 0.990 0.000 0.810

3.4 各组大鼠血生化指标检测结果比较 模型组大鼠T-PROT和ALB水平均高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量组大鼠T-PROT和ALB水平均低于模型组（P＜0.05）；中、高剂量组大鼠T-PROT和ALB水平均低于低剂量组（P＜0.05）；高剂量组大鼠T-PROT和ALB水平均低于中剂量组（P＜0.05）。各组大鼠BUN、SCr、ALT及AST比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠血生化指标检测结果比较 （±s）

表4 各组大鼠血生化指标检测结果比较 （±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别 n BUN/（mmol/L） SCr/（μmol/L）ALT/（U/L） AST/（U/L） T-PROT/（g/L） ALB/（g/L）对照组 10 6.17±0.72 30.94±1.64 64.81±8.55 92.85±11.32 60.78±1.89 33.45±2.15模型组 10 6.28±0.64 33.02±1.87 63.71±8.75 95.84±10.15 118.32±12.05a 79.65±5.74a低剂量组 10 6.54±0.67 31.78±1.87 60.76±7.92 94.65±10.21 94.43±6.76b 58.20±3.12b中剂量组 10 6.45±0.75 32.48±2.13 61.85±6.51 93.77±12.42 77.12±4.05b c 49.61±2.79b c高剂量组 10 6.70±0.81 32.74±3.18 61.28±7.15 94.48±13.40 65.42±1.25b c d 35.72±2.87b c d F 0.845 1.442 0.480 0.092 130.349 279.418 P 0.504 0.236 0.750 0.985 0.000 0.000

3.5 各组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量比较 模型组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量均高于对照组（P＜0.05）；低、中、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量均低于模型组（P＜0.05）；中、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量均低于低剂量组（P＜0.05）；高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量均低于中剂量组（P＜0.05）。（见表5）

表5 各组大鼠血清IL-6、IL-8 和TNF-α 含量比较（±s，pg/mL）

表5 各组大鼠血清IL-6、IL-8 和TNF-α 含量比较（±s，pg/mL）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别 n IL-6 IL-8 TNF-α对照组 10 42.36±4.19 55.19±5.12 48.39±5.03模型组 10 158.39±10.23a 169.34±10.17a 182.32±12.30a低剂量组 10 96.65±7.25b 110.23±8.92b 108.66±8.23b中剂量组 10 72.36±5.13bc 80.37±6.51bc 75.23±5.25bc高剂量组 10 58.23±4.23bc d 61.36±5.13bc d 57.34±4.39bc d F 468.910 390.800 506.216 P 0.000 0.000 0.000

4 讨 论

放射治疗广泛应用于肿瘤患者的临床治疗中，在肿瘤的综合治疗中发挥了重要作用[15]。放疗可控制病灶，提高生活质量，但也存在并发症。其中常见的并发症为放射性直肠炎，其主要原因在于直肠对于放射线敏感性相对较高[16]。虽然目前现代医学在放疗技术上尽可能减少了放射区域内正常组织的损伤，同时也通过多种药物甚至是手术对放射性直肠炎的治疗进行探究，并取得了一定的成效。但是目前的治疗方法包括谷氨酰胺、中医治疗等均有各自的优点和不足，尚无统一的疗效评价标准[17-18]。中医学多将此病归属为“腹痛”“痢疾”等范畴。放射线是其发生的主要因素，病因为外来“毒、热、火”邪[19]。放射性直肠炎总属热毒内侵、正气不足，火热毒邪直犯肠腑，最终引发便血等症状。故中医治疗当以清热凉血为基本治疗策略。

治疗放射性直肠炎要充分结合患者的自身情况及病情等多方面因素，制定合适的方案。鉴于直肠黏膜有很好的吸收能力，保留灌肠可以将药物直接作用于受损部位，经渗透吸收后改善微循环，从而增加药物在局部的作用。保留灌肠操作简单，且副作用小[20]。因此，保留灌肠常被应用于临床放射性直肠炎的治疗中[21]。消痔灵由五倍子、明矾、鞣酸等组成，具有收敛、涩肠、止血等作用，能够减轻炎症的渗出反应；庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，具有抗感染作用；谷氨酰胺具有止泻、抗炎等功能；美沙拉嗪具有明显的抗炎、黏膜修复作用，可减轻肠壁炎症、修复黏膜。四药联合保留灌肠可以起到修复黏膜、收敛止血、抗炎、止泻等作用[8]。本课题的前期实验构建了SD大鼠放射性直肠炎模型后，通过使用消痔灵、谷氨酰胺、美沙拉嗪、庆大霉素保留灌肠，并与蒙脱石散、庆大霉素、地塞米松保留灌肠进行比较。结果表明消痔灵、谷氨酰胺、美沙拉嗪、庆大霉素保留灌肠具有很好的疗效，不仅能够防治急性放射性直肠炎，还能降低慢性直肠炎的发病率，减轻炎症损伤程度[8]。本研究在前期研究基础上通过对SD大鼠的一般体征、直肠组织病理变化、血常规、血生化指标及血清中炎症因子等指标进行分析，对该复方灌肠剂进行药效学研究，旨在为今后的研究提供参考。

本研究通过6 MV-X射线局部单次大剂量（25 Gy）照射的方式构建放射性直肠炎模型。结果显示，模型组大鼠饮食量、饮水量下降，体质量减轻；大鼠安静，反应迟钝，皮毛光泽度下降；同时大鼠表现出排便异常，如中度稀便、黏液便、粪便出血等。直肠组织HE染色显示，模型组大鼠直肠黏膜隐窝扩张，结构消散，同时上皮发生萎缩，杯状细胞数量减少，存在大量中性粒细胞浸润，发生炎症损伤。以上结果证实SD大鼠放射性直肠炎模型构建成功[22]。大鼠血常规、血生化指标及炎症因子检测发现，模型组大鼠WBC降低，RBC、HGB、HCT、T-PROT、ALB水平升高；同时模型组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α含量亦升高，与王毓国等[23]的研究一致。以上结果证明了大鼠一般体征、病理学变化、RBC、HGB、T-PROT、ALB的波动及炎症因子的上调均与放射性直肠炎病程发展有关。本研究参照前期实验[8]用药量根据大鼠体质量进行换算，得到药物的常规配制剂量，以此为标准，以1倍、2倍、4倍的剂量梯度设置进行剂量筛选。结果显示，使用不同剂量药物保留灌肠后，大鼠的进食量、饮水量增加，体质量也逐渐恢复正常；大鼠的活动量、皮毛光泽度有一定的恢复，排便也逐渐正常。低、中、高剂量组大鼠一般体征评分明显低于模型组，同时直肠病理损伤评分也逐渐降低，提示四药联合保留灌肠可发挥止泻、修复黏膜的作用，从而使放射性直肠炎大鼠排便恢复正常，也可使肠吸收能力增强，体质量增加。此外，放射性直肠炎引起的血常规、血生化指标及炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α水平异常也得到明显改善，且随着药物剂量的增加，其改善作用也越来越明显，其中高剂量组作用最为显著。表明四药联合保留灌肠可能通过抑制IL-6、IL-8和TNF-α的合成与释放，减轻炎症浸润、黏膜组织损伤程度，从而保护血管和直肠黏膜，达到治疗放射性直肠炎的效果。

综上所述，消痔灵、谷氨酰胺、美沙拉嗪、庆大霉保留灌肠治疗放射性直肠炎，安全有效，且以高剂量最为合适。研究结果可为放射性直肠炎的临床治疗提供参考。然而，本研究还存在不足，如灌肠药物为混悬液，容易出现堵管现象而增加操作的难度，后续将考虑制成栓剂以延长药物保留时间。