一测多评法同时测定小儿感冒宁糖浆中8种成分的含量

李 帆，杨 滢，缑慧君，许雪峰，杨 涵

（汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西 汉中 723000）

小儿感冒宁糖浆由金银花、连翘、牛蒡子、黄芩等15种药材组成，具有疏散风热、清热止咳的功效，临床多用于治疗小儿外感风热所致的感冒。症状为发热、汗出不爽、鼻塞流涕、咳嗽咽痛等[1]。2020年版《中华人民共和国药典》一部仅以黄芩苷这一单一成分来进行质量控制，并且在目前所能查到的文献中也仅对其4种成分进行定量分析[2]。对于成分复杂的儿童用药来说，仅靠控制单一的中药有效成分群的含量，难以客观并全面地评价产品的质量[3]。本研究建立了小儿感冒宁糖浆中绿原酸、栀子苷、连翘苷、牛蒡苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的一测多评（QAMS）法，以黄芩苷为内标物，通过测定黄芩苷的含量，得出其他7种成分的含量。本法简单准确，在降低含量测定检验成本的同时缩短了检验时间，为小儿感冒宁糖浆的质量控制提供了新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Thermo U3000型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（美国赛默飞公司）；岛津LC-20A型高效液相色谱仪，配备SPD-20A检测器（日本岛津公司）；赛多利斯BS224S、BT-25S型电子天平（德国赛多利斯公司，精度分别为万分之一、十万分之一）；KQ-250DE型超声波清洗机（江苏昆山市超声仪器有限公司，功率：400 W，频率：40 kHz）；TDL80-2B型台式离心机（上海安亭科学仪器有限公司）。

图1 HPLC 图

1.2 试剂与试药 小儿感冒宁糖浆（批号：20200410，20200320）购于吉林益民堂制药有限公司；小儿感冒宁糖浆（批号：200301，210301）购于成都迪康药业有限公司。绿原酸对照品（批号：110753-202018，纯度：99.3%）、栀子苷对照品（批号：110749-201919，纯度：97.6%）、牛蒡苷对照品（批号：110819-201812，纯度：95%）、连翘苷对照品（批号：110819-202117，纯度：94.9%）、黄芩苷对照品（批号：110715-202122，纯度：94.2%）、汉黄芩苷对照品（批号：112002-201702，纯度：98.5%）、黄芩素对照品（批号：111595-201808，纯度：97.9%）、汉黄芩素对照品（批号：111514-201706，纯度：98%）均购于中国食品药品检定研究院；色谱纯甲醇（德国Merck公司）；优级纯磷酸（天津市大茂化学试剂厂）；超纯水经Milli-Q integral5纯水机制备；阴性对照品药材：薄荷（批号：2011016）、荆芥穗（批号：2106001）、苦杏仁（批号：20220101)、牛蒡子（批号：200601）、黄芩（批号：20220302）、桔梗（批号：211002）、前胡（批号：20130301）、白芷（批号：211101-03）、炒栀子（批号：C232220501）、焦山楂（批号：200101）、六神曲（批号：211001A50）、焦麦芽（批号：2101001）、芦根（批号：20220201）、金银花（批号：200701）、连翘（批号：Y220301）均购置于汉中市人民医院，并由本课题组许雪峰副主任药师、缑慧君副主任药师鉴定为正品，且所有药材经检测均符合《中华人民共和国药典》标准。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Waters XSelect HSS T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0~5.0 min，13.0%A~32%A；5.0~40.0 min，32%A~70%A；40.0~60.0 min，70%A~13%A）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为227、327 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，加70%甲醇制成绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素质量浓度分别为0.57 00、0.812 0、2.202 0、0.514 4、2.223 1、0.910 0、0.512 0、0.375 0 mg/mL的混合对照品储备液；精密吸取1 mL置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，即得绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素质量浓度分别为57.00、81.20、220.20、51.44、222.31、91.00、51.20、37.50 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品约6 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加70%甲醇适量，摇匀，超声处理30 min，放冷至室温，加70%甲醇至刻度，2 000 r/min离心10 min，精密量取上清液5 mL置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，滤过，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按照小儿感冒宁糖浆的制备工艺和处方，分别制备缺金银花、栀子、牛蒡子、连翘、黄芩的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 取“2.2”项下各溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样分析，结果发现各成分色谱峰分离度均大于1.5，不对称度在0.99~1.01之间，理论塔板数按黄芩苷计不低于90 962，各阴性对照品在相应位置均无干扰。

2.3.2 线性关系及检测限、定量限的确定 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.1、1、2、3、4、5 mL置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，制成不同浓度的混合对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样测定，以各成分的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。用甲醇逐步稀释混合对照品溶液并进样，以信噪比为3时的含量为检测限，信噪比为10的含量为定量限。（见表1）

表1 8 种成分的线性关系和检测限、定量限

2.3.3 精密度试验 取同一批小儿感冒宁糖浆样品（批号：20200410），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，并记录各组分的峰面积，测得绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.52%、0.22%、0.95%、0.86%、0.11%、0.46%、0.53%、0.44%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批小儿感冒宁糖浆样品（批号：20200410），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、6、8、12、18、24、32 h按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品峰面积RSD分别为0.56%、1.26%、0.09%、0.92%、0.11%、0.17%、1.86%、1.54%。表明供试品溶液在32 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批小儿感冒宁糖浆样品（批号：20200410），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，测定并计算各成分的含量。结果绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量的RSD分别为0.93%、0.88%、1.81%、0.94%、1.09%、1.44%、1.95%、1.32%。表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的小儿感冒宁糖浆样品（批号：20200410）共6份，每份约3 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定并计算回收率。结果绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均加样回收率（n=6）在94.86%~101.19%之间；RSD为0.74%~1.88%。表明方法准确度良好。（见表2）

表2 加样回收率试验结果 （n=6）

2.4 相对校正因子（fm/s）的确定 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样，以黄芩苷为内标物，计算绿原酸、栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的fm/s。计算公式fm/s=fm/fs=（CmAs）/（CsAm），公式中Cm为待测组分含量，Am为待测组分峰面积，Cs为内标物含量，As为内标物峰面积。（见表3）

表3 8 种组分的相对校正因子

2.5 耐用性试验

2.5.1 不同仪器、色谱柱对fm/s的影响 精密吸取“2.2.1“项下混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别采用不同品牌仪器和色谱柱进行测定，考察2台高效液相色谱仪（Thermo U3000，岛津LC-20A）和3个品牌色谱柱（Waters XSelect HSS T3 C18、Thermo AcclaimTM120 C18、SVEATM A585V3 C18）分别对fm/s值的影响，结果见表4。

表4 不同仪器及色谱柱对fm/s 的影响

2.5.2 不同柱温对fm/s的影响 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别采用不同柱温进行测定，考察柱温24、26、28、30、32 ℃对fm/s值的影响，结果表明柱温对各成分fm/s均无明显影响。（见表5）

表5 不同柱温对fm/s的影响

2.5.3 不同流速对fm/s的影响 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别采用不同流速进行测定，考察流速0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min对fm/s的影响，结果表明流速对各组分fm/s值均无明显影响。（见表6）

表6 不同流速对fm/s的影响

2.5.4 色谱峰的定位 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，对不同仪器和色谱柱进行相对保留时间的考察，结果表明不同仪器和色谱柱的相对保留时间无显著差异（RSD＜2%）。（见表7）

表7 不同仪器和色谱柱的相对保留时间

2.6 一测多评法和外标两点法测定结果比较 取不同厂家生产的4批样品，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别使用外标法和一测多评法计算各组分含量。结果表明，两种方法所得各组分含量无明显差异（RSD＜2%）。（见表8）

表8 8 种成分ESM 和QAMS 测定结果 （mg/g）

3 讨 论

3.1 色谱条件的优化 本试验测定的8种组分最大吸收波长均不相同，为保证各组分均有合适的灵敏度和精密度[4]，对供试品溶液和对照品溶液用二极管阵列检测器在210~440 nm进行扫描，发现227 nm处栀子苷、牛蒡苷、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素8种成分均有吸收，且有较好的色谱参数；而绿原酸则存在较大差异，在327 nm处有最大吸收。故确定检测波长为227 nm、327 nm。

本试验分别考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等不同流动相系统[5-8]，经比对发现当流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液时8种组分的分离度均大于1.5。本实验分别考察了不同的柱温（24、26、28、30、32℃）、不同的流速（0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min）下各组分的分离效果，发现在30 ℃、1.0 mL/min时，各组分色谱峰分离效果和峰型较好。本实验分别考察了2个不同品牌仪器（Thermo U3000、岛津LC-20A）、3个不同品牌的色谱柱（Waters XSelect HSS T3 C18、Thermo AcclaimTM120 C18、SVEATM A585V3 C18），发现上述仪器、色谱柱均能达到良好的分离效果和重现性。

3.2 供试品溶液提取方法选择 本试验分别使用甲醇、70%甲醇、95%乙醇、70%乙醇对供试品进行提取[9-12]，结果表明70%甲醇对8种组分提取效率最佳。本实验分别采用不同提取时间（30、45、60 min）和不同提取方法（超声、回流）[13-18]对供试品溶液进行提取，发现超声30 min时各组分提取效率最高，故最终确定70%甲醇超声提取30 min作为供试品的提取方法。

4 小 结

小儿感冒宁糖浆中金银花清热解毒，疏散风热；连翘清热解毒，消肿散结，两者合为君药。牛蒡子疏散风热，宣肺透疹，解毒利咽，为臣药。黄芩清热燥湿，泻火解毒；栀子泻火除烦，清热利湿，凉血解毒，二者合为佐药。诸药合用有疏散风热、清热止咳的功效[19]。本试验参照中药质量标志物确认原则[20-22]，兼顾“君、臣、佐”药的代表性物质，选取稳定性好，价格低廉的黄芩苷作为内标物，同时测定绿原酸、栀子苷、连翘苷、牛蒡苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量，以多指标成分的角度为小儿感冒宁糖浆的质量控制提供参考。