基于药效学结合响应面法优选穿王消炎片提取工艺研究*

李 鹤，龚来觐，陈冬平，杨 琴

（江西农业工程职业学院中医药学院，江西 樟树 331200）

穿王消炎片为中药复方制剂，源于《国家中成药标准汇编》，由穿心莲、了哥王两味中药组成，具有消炎、解毒功效，用于痰热咳喘、腹痛，以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎，急性肠胃炎、急性菌痢见以上症状者[1]。穿心莲来源于爵床科属植物穿心莲干燥地上部分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化应激、消炎、抗菌等广泛药理作用[2-4]。了哥王来源于瑞香科植物了哥王干燥根[5]，具有抗菌、消炎镇痛、抗病毒等药理作用[6-7]，疗效确切，但有一定毒副作用。有文献指出，了哥王有大毒，其果实、茎、叶和根皮均有毒，中毒时可导致腹泻、呕吐等消化道反应及皮疹等皮肤反应[8]。

以往文献中穿心莲和了哥王大部分以乙醇为溶剂采用超声、渗漉、回流等方法提取[9-10]，两味药材的提取方法及提取工艺参数如乙醇的浓度、用量等均不同[11-12]。因此传统工艺中将穿心莲和了哥王分别提取，再合并浓缩制成稠膏[13-15]，且尚未考虑了哥王毒性对用药安全的影响，同时未对提取成分的抗炎药效和毒性进行药效学验证。

了哥王的炮制减毒方法为“汗渍法”[16-17]，故本研究模拟汗渍减毒的方法采用人工汗液与乙醇的混合溶剂进行提取，达到减毒增效的作用。为便于工业大生产的推广，本研究选择加热回流的方法同时提取两味药材，以简化生产工艺流程。结合单因素试验和响应面法优化提取工艺参数，综合评价穿王消炎片抗炎疗效、肝毒性和浸膏收率。全面考察穿心莲和了哥王提取的影响因素，以期获得最佳的穿王消炎片提取方法和生产工艺，为工业生产提供实验依据。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF级雄性Wister大鼠168只，体质量180～200 g，购于北京维通利华实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006。大鼠于室内保持12 h光照，12 h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，且控制室内温度为（25±1）℃，相对湿度在（50±10）%。本实验方案经过江西农业工程职业学院实验动物伦理审查委员会审核，符合实验动物伦理学规定，审查编号：JNDL-20210910。

1.2 药物及试剂 穿心莲、了哥王药材均购于江西樟树药材交流中心，经龚福保教授鉴定，穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees的干燥地上部分，了哥王为瑞香科荛花属植物了哥王Wikstroemia indica (Linn.) C.A. Mey的干燥根。天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（批号：20200610）购于南京建成生物工程研究所；人工汗液：含L-组氨酸盐酸盐0.5 g/L、氯化钠5 g/L、二水合磷酸二氢钠2.2 g/L，用0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.5，即得；其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 CP213型电子天平（美国奥豪斯）；MIKRO 220R型低温高速离心机（德国Hettich公司）；ADVIA 1800型全自动生化分析仪（德国Siemens Healthcare Diagnostics公司）。

2 方 法

2.1 提取 根据穿王消炎片处方，取60 g穿心莲和40 g了哥王粉碎成粗粉，加8倍量30%的人工汗液乙醇溶液（V人工汗液∶V乙醇=30∶70），于60 ℃加热提取2次，每次2 h，合并提取液，过滤，浓缩成稠膏状，干燥至恒重，得穿王干膏。称重，计算浸膏收率。

2.2 分组与给药 取雄性Wistar大鼠168只，按体质量随机分组，包括：40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃试验组，10%、20%、30%、40%、50%试验组，响应面1～17试验组及模型组，每组6只。各试验组大鼠分别灌胃穿王干膏[用1.0%羧甲基纤维素钠（CMC）配制成混悬液]，给药剂量均为2.2 g/kg；模型组大鼠灌胃给予等体积1.0% CMC蒸馏水混悬液；大鼠灌胃的体积均为20 mL/kg，1次/d，连续给药1周。给药期间正常供给饲料与水。

2.3 抗炎效果测定 采用角叉菜胶致大鼠足跖炎症模型。末次给药前，用记号笔在每只大鼠的右后肢踝关节周围做上记号，用容积法测定足容积为致炎前足容积，然后各组大鼠再灌胃给药，1 h后将1%角叉菜胶0.1 mL注入大鼠右后足跖腱膜下致炎，致炎3 h后再次测定足容积为致炎后足容积，以致炎前、后足容积之差（即肿胀度）为指标，计算每只大鼠的足肿胀抑制率。足肿胀抑制率=（模型组肿胀度-试验组肿胀度）/模型组肿胀度。

2.4 肝毒性测定 采用肝功能生化指标AST测定法。“2.3”项下大鼠腹主动脉取血，血液静置40 min，12 000 r/min离心15 min，分离血清，于-20 ℃保存，用全自动生化分析仪测定血清AST水平。

2.5 单因素试验 前期预试验发现，提取温度对足肿胀抑制率、AST值、浸膏收率3个指标中的足肿胀抑制率影响明显，人工汗液乙醇溶液用量对浸膏收率影响显著，人工汗液乙醇浓度对足肿胀抑制率及AST值影响显著，因此单因素试验中以足肿胀抑制率为指标考察适宜提取温度，以浸膏收率为指标考察适宜人工汗液乙醇溶液用量，以足肿胀抑制率和AST值为指标考察适宜人工汗液乙醇浓度。故单因素试验的筛选条件设为：（1）提取温度分别在40、50、60、70、80 ℃下，按“2.1”项下方法提取，其他条件不变，测定浸膏的抗炎效果，初步确定合适的提取温度。（2）人工汗液乙醇溶液用量分别用4、6、8、10、12倍量，按“2.1”项下方法提取，其他条件不变，计算浸膏收率，初步确定合适的人工汗液乙醇溶液用量。（3）分别采用10%、20%、30%、40%、50%人工汗液乙醇，按“2.1”项下方法提取，其他条件不变，测定浸膏的抗炎效果和肝功能指标，初步确定合适的人工汗液乙醇浓度。

2.6 响应面试验 在单因素试验基础上，应用Design-Expert 13.0软件进行Box-Behnken试验设计。以提取温度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液配比（X3）为响应面设计因素，大鼠足肿胀抑制率（Y1）、肝功能生化指标（Y2）、浸膏收率（Y3）的综合评分（Y）为响应值，应用三因素三水平进行响应面优化试验，优化穿王消炎片的提取条件[18]。其中Y以Y1、Y2、Y3的总评“归一值”计算，根据3个指标对穿王消炎片提取影响的重要性，设定各自权重分别为0.5、0.3、0.2，Y=（Y1/Y1max）×50%+（100+Y2min-Y2）×30%+（Y3/Y3max）×20%，式中Y2越小越好，将各试验组中Y2min定为100分，其余各组按100+Y2min-Y2计算分数。

2.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，穿王消炎片提取物各试验组分别与模型组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取温度 随着温度升高，抗炎效果呈上升趋势，其中60 ℃试验组大鼠足肿胀度最小，提示抗炎效果最佳；当提取温度超过60 ℃时，大鼠足肿胀度变大，其抗炎效果下降。由此可知，在一定温度范围内，温度升高其有效组分的溶出增大，抗炎效果也增加；但温度过高，其抗炎有效成分会被破坏，使其抗炎效果下降。故选取50、60、70 ℃提取温度进行下一步试验。（见表1）

表1 提取温度对抗炎效果的影响 （±s）

表1 提取温度对抗炎效果的影响 （±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

组别 n 肿胀度/mL 肿胀抑制率/%模型组 6 0.419±0.153 -40 ℃试验组 6 0.407±0.168 3.13±1.67images/BZ_31_317_787_318_788.png50 ℃试验组 6 0.335±0.132 19.32±8.34 60 ℃试验组 6 0.239±0.081a 42.13±14.92 70 ℃试验组 6 0.286±0.116a 30.46±11.68 80 ℃试验组 6 0.382±0.141 9.05±4.25

3.1.2 人工汗液乙醇溶液用量 随着人工汗液乙醇溶液用量的增加浸膏收率也呈增加趋势，但在人工汗液乙醇溶液用量到8倍用量后，再增加其用量，浸膏收率变化不大，故选取6、8、10倍量人工汗液乙醇溶液进行下一步试验。（见表2）

表2 人工汗液乙醇用量对浸膏收率的影响

3.1.3 人工汗液乙醇浓度 与模型组比较，10%、20%人工汗液乙醇组大鼠血清AST水平明显升高（P＜0.05）；30%、40%、50%人工汗液乙醇组大鼠血清AST水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，10%、20%、30%人工汗液乙醇组大鼠足肿胀度明显减小（P＜0.05）；40%、50%人工汗液乙醇组大鼠足肿胀度与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。故选取20%、30%、40%人工汗液乙醇溶浓度进行下一步试验。（见表3）

表3 人工汗液乙醇浓度对毒性和抗炎效果的影响 （±s）

表3 人工汗液乙醇浓度对毒性和抗炎效果的影响 （±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

组别 n AST/（U/L） 肿胀度/mL 肿胀抑制率/%模型组 6 125.42±17.83 0.419±0.153 -10%人工汗液乙醇组 6 209.52±25.37a 0.227±0.068a 44.93±15.7 20%人工汗液乙醇组 6 173.15±23.48a 0.205±0.064a 49.38±16.24 30%人工汗液乙醇组 6 122.74±16.87 0.242±0.072a 41.87±13.65 40%人工汗液乙醇组 6 127.89±19.54 0.353±0.140 14.85±6.49 50%人工汗液乙醇组 6 124.63±18.05 0.395±0.174 5.97±2.86

3.2 响应面法优化穿王消炎片的提取工艺条件

3.2.1 模型建立与显著性检验 根据单因素试验结果及Box-Benhken试验设计原理，对提取温度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液（X3）3个因素设计的3个编码水平见表4。按响应面1～17试验组条件进行试验，测大鼠足肿胀抑制率（Y1）、肝功能生化指标（Y2）、浸膏收率（Y3）3个指标，计算综合评分（Y），结果见表5。

表4 响应曲面因素及水平编码值表

表5 响应曲面因素及水平编码值表

对表5进行多元回归拟合，得自变量提取温度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液浓度（X3）与因变量综合评分（Y）之间的线性回归方程为Y=87.56+6.63X1+2.36X2-2.43X3-1.12X1X2-3.17X1X3-3.09X2X3-13.17X12-4.81X22-6.68X32。

回归模型方差分析结果见表6。模型P＜0.000 1，表明回归模型极显著；失拟项P=0.186 1＞0.05，模型失拟项不显著，说明残差是由随机因素引起，回归方程拟合度和可信度较高，使用该方程模拟实际的三因素三水平分析可行。决定系数R2=0.984 5＞0.95，说明此模型拟合度很高，与实际情况相符，且误差较小，能充分反映出各因素与响应值之间的关系；校正决定系数Radj2=0.964 6，说明此模型可解释96.46%数据变异性。各因素之间存在着一定交互作用，X1、X3、X12、X22、X32为极显著项（P＜0.01），X2、X1X3、X2X3为显著项（P＜0.05），而X1X2对综合评分影响不显著（P＞0.05）。根据F值可判断，3个因素对综合评分的影响顺序为X1＞X3＞X2。

3.2.2 提取工艺响应面分析及优化 根据显著性分析绘制响应面图，由等高线可得，X1X3、X2X3交互作用显著（等高线呈椭圆形），X1X2交互作用不显著（等高线呈圆形）。由响应面可知，提取温度和人工汗液乙醇溶液浓度对综合评分有显著影响，表现为响应面陡峭，而人工汗液乙醇溶液用量的响应面较为平缓，对综合评分的影响不显著。（见图1～3）

图1 因素X1 和X2 对穿王消炎片提取工艺的影响

图2 因素X1 和X3 对穿王消炎片提取工艺的影响

图3 因素X2 和X3 对穿王消炎片提取工艺的影响

3.2.3 提取工艺验证 利用Design-Expert的Numerical分析得最佳提取工艺条件：提取温度为62.76 ℃，人工汗液乙醇溶液用量为8.63倍量，人工汗液乙醇溶液浓度为26.8%，在此条件下的综合评分为89.24。为验证响应面结果的可靠性，结合实际操作方便，将工艺参数进行调整优化：提取温度为63 ℃，人工汗液乙醇溶液用量为8.5倍量，人工汗液乙醇溶液浓度为27%，在此条件下进行3组平行试验，结果综合评分的均值为89.12，与回归模型预测值有良好的吻合性，说明模型可靠，可用于穿王消炎片的提取。

4 讨 论

穿王消炎片其功效主要是消炎解毒。临床可用于痰热咳喘，腹痛，以及急慢性扁桃体炎、咽喉炎、肺炎、急性肠胃炎和急性菌痢等炎症。其作为“绿色消炎药”具有广阔的市场前景，但目前提取方法大都将两味药分别提取，生产工序既繁琐复杂，且不符合中医整体煎煮的用药思想。故对其提取工艺进一步研究。

当前两者的提取工艺大都采用测定提取物中某类有效成分的含量，如对穿心莲内酯、总黄酮等进行评价[9-11]。此评价方法不能反映提取物中所有成分的药效，因此本试验以药效学指标进行评价，可反映提取工艺的真实效果。本试验尝试用乙醇合并提取，并找出最适浓度，同时考虑到了哥王毒性，模拟“汗渍法”采取人工汗液和乙醇作为混合溶剂提取其有效成分，降低毒性。本试验提取方法改变了以往对穿心莲和了哥王的提取均采用不同浓度的乙醇或甲醇分别提取的方法[12-15]。同时本研究使用造角叉菜胶致大鼠足跖炎症模型，以大鼠足肿胀抑制率为药效评价指标，全面评价提取物的抗炎效果。

肝脏是药物代谢的主要器官，药物肝毒性一直是药物安全性评价的重点之一。AST是反映肝细胞损伤的重要指标，符合本试验评价药物毒性的指标。鉴于生产的经济效益，本研究选取浸膏收率为提取完全的评价指标。故本研究以足肿胀抑制率、AST值、浸膏收率为综合评价指标，全面评价穿王消炎片的提取工艺，以期较全面反映提取工艺的合理性。

单因素试验和响应面优化试验中大鼠足肿胀抑制率结果显示，提取温度在60 ℃左右、人工汗液乙醇溶液浓度在低于30%时提取物的抗炎效果较好，可能有以下两方面原因：一是提取温度过低则有效成分溶出不完全，而提取温度过高，导致穿心莲内酯水解；二是人工汗液乙醇溶液浓度过高，使乙醇含量少致有效成分溶出少。由AST值可知，人工汗液乙醇溶液浓度在30%以上时，其肝毒性较小，而低于30%时肝毒性较大，说明用人工汗液提取能降低了哥王的毒性。由浸膏收率可知，人工汗液乙醇溶液用量到8倍量以上时，其浸膏收率的增加不明显，低于8倍量则提取不完全。

本试验采用响应曲面法对穿心莲与了哥王合并提取，进一步优化工艺程序。对提取温度、人工汗液乙醇溶液用量、人工汗液乙醇溶液浓度3个因素各水平进行分析，发现提取温度和人工汗液乙醇溶液用量两者的交互作用对综合评分有显著影响，反映了因素间的交互作用，并以较少试验次数对因素间的非线性关系进行研究，克服了正交试验只能对试验点进行分析而不能给出整个区域最优值，精度不高的缺点。本研究通过响应曲面法建立了穿心莲与了哥王合并提取工艺的二次多项式数学模型，得出了最佳提取工艺条件：提取温度为63 ℃，人工汗液乙醇溶液用量为8.5倍量，人工汗液乙醇溶液浓度为27%（V人工汗液∶V乙醇=27∶73）。在此条件下进行工艺验证，结果验证值与回归模型预测值有良好的吻合性，模型拟合程度高，试验误差小。

综上，本试验采用的提取工艺使提取物抗炎药效高、毒性低和副作用小，可为工业生产和临床用药提供参考。