基于数据挖掘和网络药理学探讨王孟庸治疗慢性肾小球肾炎用药规律及机制*

谢 伟，白 茸，刘雪梅，黄宝利，冯乐怡，蔡桂章，李俊荣，吴勇汇

（1.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033；2.黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.上海中医药大学，上海 201203；4.深圳市中医院，广东 深圳 518033）

慢性肾小球肾炎（chronic glomerulonephritis，CGN）是以血尿、蛋白尿、水肿、高血压为主要临床表现的一组肾系疾病，由不同的原发性肾小球疾病发展而来，与原发性疾病免疫炎症损伤关系密切。本病病程迁延，最终可至慢性肾衰竭。在我国所有泌尿系统疾病中，慢性肾小球肾炎的发病率为21.63%。在引起终末期肾衰竭的各类病因中，慢性肾小球肾炎占60%以上，高居首位，远超其余肾脏疾病[1]。目前西医治疗本病主要采用糖皮质激素、免疫抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂及对症治疗等。但激素、免疫抑制剂治疗疗程长，且副作用大，血管紧张素转换酶抑制剂目前使用较多的是贝那普利[2]。本病属于中医“慢肾风”“水肿”等范畴，中医药治疗慢性肾小球肾炎临床疗效确切，多采取中药汤剂辨证治疗[3-5]。应用中医传承辅助平台对名老中医用药规律进行分析，具有重要的指导意义。

王孟庸，深圳市中医院主任中医师，国家名老中医专家，全国名老中医传承工作指导老师，广东省名中医，兼任中华中医药学会肾病专业委员会委员。王孟庸教授从事中西医结合治疗肾病工作五十余年，造诣极深，以处方精炼，用药轻灵而著称。故本研究基于数据挖掘和网络药理探讨王孟庸治疗慢性肾小球的用药规律及机制，旨在为慢性肾小球肾炎的防治提供中医方案。

1 资料与方法

1.1 处方来源 资料收集于2013年1月1日至2021年8月30日深圳市中医院肾病科门诊王孟庸接诊的所有慢性肾小球患者病历。本研究已通过医学伦理委员会审查（批件号：K2023-079001）。

1.2 处方筛选

1.2.1 诊断标准 慢性肾小球肾炎诊断参照《慢性肾小球肾炎的诊断、辨证分型及疗效评定》[6]，具体如下：（1）起病隐匿，进展缓慢，病情迁延。肾功能随病情发展逐渐减退，后期可出现贫血、电解质紊乱、血肌酐升高等情况。（2）尿检查异常，常有长期持续性蛋白尿或血尿，尿蛋白定量常＜3.5 g/24 h，可有不同程度的水肿、高血压等表现。（3）病程中可因呼吸道感染等原因诱发急性发作，出现类似急性肾炎的表现。（4）排除继发性肾小球肾炎后，方可诊断为原发性肾小球肾炎。

1.2.2 纳入标准 （1）符合CGN西医诊断标准者；（2）中医证型诊断明确者；（3）四诊及治疗资料完整者。

1.2.3 排除标准 （1）高血压肾病、糖尿病肾脏病等各种继发性肾炎患者；（2）服用激素等免疫抑制剂患者；（3）妊娠、哺乳期患者。

1.3 数据规范化处理 依据2020年版《中华人民共和国药典》对369份处方的中药名称进行规范化处理。

1.4 数据录入与核对 为了确保数据的准确性，将符合条件的方药、中医诊断录入中医传承辅助平台后，由两人负责数据审核。

1.5 数据分析 借助中国中医科学院研发的“中医传承辅助平台（V2.5）”，统计常用药物频数及其四气、五味、归经。在软件用药模式界面，将“支持度”设置为70，将“置信度”设置为0.65，得出主要药物之间的关联度及其网络展示。得出核心处方。

1.6 网络药理学机制探究 借助TCMSP数据库[7]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）对核心药物的化学成分进行检索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性[8]（drug likeness，DL）≥0.18进行筛选，确定各药物活性成分后依次进行各成分靶点的收集，通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）完成靶点与基因名的匹配。同时在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、TTD[9]数据库中输入关键词“chronic glomerulonephritis”，收集疾病的相关靶标，利用Venny软件将药物的靶点与疾病的靶点进行映射，得到核心药物治疗CGN的关键靶点。利用Cytoscape构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，采用STRING平台[10]（https://string-db.org/）对关键靶点进行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析，通过David数据库[11]（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO和KEGG通路富集分析。

1.7 分子对接 从Pubchem数据库中下载槲皮素、山奈酚的sdf文件，从PDB数据库中下载AKT1[12]、VEGFA、IL-6[13]分子结构。使用AutoDockTools vina 1.1.2将蛋白转化为pdbqt文件，参考IL-6蛋白原配体结合位点确定对接区域，活性中心Gridbox的位置设置为槲皮素-IL6：center_x=3.359，center_y=-0.441，center_z=1.458；山奈酚-IL6：center_x=-0.194，center_y=0.341，center_z=0.3；大小均设置为size_x=60，size_y=60，size_z=60。使用Autodock vina 1.1.2进行分子对接，计算affinity值（kcal/mol）。同时使用PyMol 1.8进行作图展示。

2 结 果

2.1 用药规律挖掘

2.1.1 用药及性味统计 录入的369份处方中共出现234味药物，其中频数前5位为黄芪、女贞子、当归、茯苓、熟地黄。频数≥20的药物61味。（见表1）药物四气以温药居多（1 496），五味以甘味为主（2 913）。（见图1）

图1 中药四气、五味频率雷达图

表1 常用高频药物 （频数≥20）

2.1.2 用药归经统计 234味药物的归经以肾经、脾经为主。（见图2）

图2 中药归经所占比重

2.1.3 主要药物组合分析 王孟庸教授最常用的药对是黄芪-当归组合，其次是黄芪-白术组合。（见表2）关联组合经常出现的药物为白术、女贞子、熟地黄、黄芪、当归、黄精、白芍、茯苓、陈皮、牡丹皮、墨旱莲11味药。（见图3）药物为二至丸、黄芪四君子汤、六味地黄丸的组成成分，相互关联，协同运用，且用药频数较高。此组合为王孟庸治疗CGN的核心方（以下简称核心方），故本研究运用网络药理学对其展开机制分析。关联规则分析显示，墨旱莲-女贞子组合的置信度最高。（见表3）

图3 主要药物网络关联图

表2 常用药物组合 （频数≥60）

表3 主要药物关联置信度 （置信度≥0.60）

2.2 核心药物网络药理学分析 对王孟庸教授处方中药的频数、组方规律进行综合分析，认为黄芪、女贞子、墨旱莲、熟地黄、当归、黄精、白芍、白术、茯苓、陈皮、牡丹皮11味中药是王孟庸教授治疗慢性肾小球肾炎核心药物，后文以“核心方”代称。

2.2.1 核心药物、CGN相关靶点筛选 对核心方药物的成分和靶点进行筛选，其中白术8个，白芍53个，陈皮47个，当归23个，茯苓5个，黄精71个，黄芪463个，墨旱莲270个，牡丹皮126个，女贞子186个，熟地黄7个，得到靶点共1 259个，合并去重后得到258个。在GeneCards、OMIM、TTD数据库中检索CGN的靶点，合并去重后得到CGN相关靶点1 849个。将核心中药靶点与CGN相关靶点映射得到中药治疗CGN的关键靶点122个。（见图4）

图4 核心方成分-疾病靶点韦恩图

2.2.2 PPI网络构建 将关键靶点导入String数据库获取PPI网络，网络中共有122个节点，2 464条边，节点度数平均值为40.4。（见图5）用Cytoscape软件对PPI网络进一步分析，得到关键节点有TNF、AKT1、IL6、VEGFA、JUN、TP53，表明这些基因在核心中药治疗CGN中具有重要作用。（见图6）

图5 核心方-CGN 靶点蛋白互作网络

图6 交集靶点互作网络图

2.2.3 疾病-药物-成分-靶点网络构建 应用Cytoscape 3.9.0软件构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，共包括176个节点和1 087条边，其中靶点占122个，疾病占1个，活性成分占42个，药物占11个，化合物度值排前4的有MOL000098槲皮素(quercetin)、MOL000422山奈酚（kaempferol）、MOL000006木犀草素（luteolin）、MOL000358β-谷甾醇（β-sitosterol），推测其为核心药物治疗CGN较为有效的活性成分。（见图7）

图7 “疾病-药物-成分-靶点”网络图

2.2.4 核心方-慢性肾小球肾炎靶点功能与通路的富集分析 对122个关键靶点进行GO和KEGG通路分析，GO富集获得733个生物过程（BP），123个分子功能（MF），66个细胞成分（CC）。KEGG通路富集得到178条信号通路。GO富集分析结果显示，排名前10的生物过程主要包括DNA、RNA转录、信号转导及基因的选择性表达、对药物的反应、细胞凋亡过程的负调节；细胞成分包括胞质溶胶、细胞核、细胞质、细胞膜等；分子功能主要涉及蛋白结合、酶结合、转录因子结合、锌离子结合等。（见图8）KEGG富集分析结果显示，显著富集的通路有癌症通路、脂质和动脉粥样硬化通路、PI3K/AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路等。（见图9）

图8 关键靶点GO 富集分析

图9 关键靶点KEGG 通路富集分析

2.2.5 分子对接 将槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）2个药物活性成分分别与关键靶点AKT1、IL6、VEGFA逐一进行对接，通过Autodock vina1.1.2进行对接，结合自由能越低,预测结合模式越好[14]。由表4可知，槲皮素、山奈酚均能与AKT1、IL6、VEGFA高效结合。运用PyMOL 1.8软件和AutoDock1.1.2的可视化软件进行对接并将其对接结果绘制为3D示意图。由图10可知，槲皮素与IL6分子结合位点为LEU65、ARG169；山奈酚与IL6分子结合位点为LEU65、LEU63。综上所述，槲皮素、山奈酚可能为核心方治疗CGN的关键活性成分，AKT1、IL6、VEGFA可能为其关键作用靶点。

图10 关键成分和靶点的结合模式图

表4 分子对接蛋白靶点结合能

3 讨 论

慢性肾小球肾炎多见尿检异常、肾性水肿、高血压。王孟庸教授根据本病水肿反复难消、病程缠绵及精微物质长期丢失等特点将本病归属于中医“虚劳病”“水肿”范畴。本病责之脾、肾二脏。《素问·经脉别论篇》曰：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行。”《素问·六节藏象论篇》曰：“肾者，主蜇，封藏之本，精之处也。”由此可见，人体之精血、津液由脾生成并布散，营养全身，而由肾摄纳，避免无故丢失，且脾主统血，全身之血皆由脾气统摄。脾肾亏损时，人体精微得不到脾之布散，肾之封藏，精微下注，病人出现尿蛋白、隐血。且脾肾阳气虚弱，蒸化失责，制约水气失司，水气盈满，流于下肢，发为水肿。水液、精微长期下聚人体，阻滞气机，影响血流，久病入络，形成瘀血，酝酿湿热。

王孟庸教授用药性味集中于甘温。《金匮要略》记载“病痰饮者，当以温药和之”。慢性肾炎水肿为中医阴水范畴，往往反复难消，责之脾肾阳虚，推动无力。王孟庸教授擅用苓桂术甘汤加减。苓桂术甘汤出自《伤寒杂病论》，主要作用于脾胃，但王孟庸教授认为三焦总司全身气化，肺脾肾布于上中下相辅相成，故其常用苓桂术甘汤配伍善走下焦之“五皮”。慢性肾小球肾炎患者多数存在长期蛋白尿，人体精微流失，肾精亏损，王孟庸教授常用药中养阴填精药频数最高，其中前五味分别是女贞子、熟地黄、黄精、墨旱莲、白芍。王孟庸教授认为久病必伤阴阳，而补阳又加重伤阴，因此善用补阴药治疗慢性肾炎，遵张景岳“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷；善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳助而泉源不竭”之旨。益气健脾药频数次之，其中黄芪用药频数最高。《本草正义》曰：“黄芪补益中土，温阳脾胃，凡中气不振，脾土虚弱，清气下陷者最益。”王孟庸教授认为脾气亏虚，清气下陷为慢性肾炎尿血、尿蛋白的关键。药理研究表明，黄芪具有抗炎、抗氧化应激、免疫调节等药理活性[15-16]。另外黄芪可以扩张血管，改善微循环，增加血流量，从而对肾小球基膜机械屏障起到保护作用[17]。益气健脾药还包括白术、茯苓、山药、党参、石斛等。瘀血是慢性肾炎发展中的重要病因。肾小球疾病的病理改变，如小球系膜增生、硬化，免疫复合物沉积，以及血管袢僵直、皱缩、玻璃样变，均可归纳为瘀血内结于肾。王孟庸教授认为久病成瘀，瘀血与体虚互为因果，致使慢性肾炎缠绵不愈。《金匮要略》云“血不利则为水”，因此当归、丹参、牡丹皮、赤芍、桃仁等活血化瘀药也为王孟庸教授临床常用。

利用网络药理学分析得到核心药物主要化合物是槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素是一种多羟基黄酮化合物，在本研究中存在于黄芪、牡丹皮、女贞子和墨旱莲等中药，具有良好的抗炎作用和免疫调节活性。有研究表明，槲皮素可通过抑制NF-κB信号通路，降低PTX3、MCP1的表达，从而减轻系膜细胞的过度增殖[18-19]；槲皮素可降低尿蛋白水平，改善肾脏超微结构，从而发挥对肾脏的保护作用[20]。槲皮素在各种慢性肾脏疾病和糖尿病肾脏病的预防和治疗中有巨大应用前景。山奈酚是白术、黄芪、女贞子和牡丹皮的主要生物活性成分之一，具有抗氧化等多种生理活性。山奈酚可修复系膜细胞，改善肾损伤和虚弱[21-22]。木犀草素是一种黄酮类成分，是女贞子、墨旱莲的活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性。木犀草素可激活Nrf2/ARE信号通路，通过抗氧化、抗炎症和抗凋亡活性，发挥对PbAc中毒的保护作用[23]。木犀草素可通过抑制氧化应激、改善抗氧化防御及下调心脏和肾脏组织中的NF-κB和Kim-1来发挥对钴毒性大鼠的保护作用[24]。

PPI网络显示，核心药物起效的关键蛋白主要是TNF、AKT1、IL6、VEGFA等。TNF-α、IL-6等都属于促炎性细胞因子，在肾小球肾炎和慢性肾脏疾病的病理生理学中发挥重要作用。TNF-α是一种由巨噬细胞、肾系膜和肾小管上皮细胞产生的促炎性细胞因子，可介导炎症性肾脏疾病。在小鼠肾小球肾炎中，未裂解跨膜TNF是肾组织损伤的重要介质，可导致肾小球细胞死亡增加和肾小球内皮细胞丢失[25]。有研究表明，内源性TNF-α的中和可减少肾小球炎症、新月体形成和肾小管间质瘢痕形成，并保留肾功能[26]。TNF-α可诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质转化，可能加重肾小球肾炎的肾间质纤维化[27]。IL-6是由各种类型的细胞产生的一种多效细胞因子，具有促炎和抗炎的双重作用[28-29]，参与系膜增生性肾炎及肾小管上皮细胞的再生。它能刺激成纤维细胞和系膜的体外增殖，在介导和调节导致肾损伤和瘢痕形成的炎症过程中发挥着重要作用。尿中IL-6水平可以更准确地预测慢性肾脏组织损伤的严重程度[30-31]，IL-6可通过调节免疫系统介导的作用加速肾小球肾炎的发展[32]。研究[33]发现，IL-1或TNF-α可刺激诱导p62与TRAF6结合，调控NF-κB的激活，从而诱发免疫炎症反应。AKT1可促进细胞存活、发育和增殖等过程，AKT1的激活可减少肾缺血再灌注期间的肾小管凋亡和炎症反应[34]。AKT1可以作为抑制AKI向CKD进展的潜在新治疗靶点[35]。姚琼等[36]研究发现黄芪可通过Akt1/mTOR自噬通路减少糖尿病肾脏病蛋白尿。VEGF可通过内皮细胞增殖调节血管生成，在受损的肾小球毛细血管的修复中发挥重要作用。VEGF的表达水平与肾炎的严重程度成正相关[37-38]。活血养阴剂[39]能抑制VEGF的分泌和表达，减少某些病理类型的慢性肾炎的蛋白尿，防止肾功能进一步恶化，从而延缓疾病进展。提高免疫力、抑制VEGF的表达对慢性肾炎的治疗有重要意义。有研究[40-41]表明，抑制NF-κB信号通路的激活及其下游炎症因子表达，上调IL-10表达，以及降低VEGF水平，能达到保护血管内皮功能的作用。作为肾小球疾病内皮细胞存活和修复的核心因素，VEGF有潜在的新途径影响以内皮细胞损伤为特征的肾小球疾病的过程，如各种肾小球肾炎、血栓性微血管病或肾移植排斥。

KEGG富集通路结果表明靶点在多种通路的调控下，核心药物可能通过调控癌症通路、脂质和动脉粥样硬化通路、PI3K/AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路来发挥治疗作用。经典的PI3K/AKT通路可调控许多慢性肾脏疾病的发展过程，包括增殖和炎症，是慢性肾脏疾病中最常见的上调通路[42]。芍药苷能通过PI3K/AKT/GSK-3β通路抑制系膜细胞增殖和炎症反应，从而改善膜增生性肾小球肾炎[43]。黄芪甲苷可通过PI3K/AKT/AS160通路激活自噬对慢性肾小球肾炎的保护作用[44]。膳食橄榄苦苷及其酰基衍生物可通过抑制JAK/STAT、NF-κB、MAPK和NLRP3炎症小体信号通路来减轻小鼠狼疮性肾炎[45]。

分子对接显示核心方的活性成分与靶点具有较好的结合能力，结合能均小于-6.7 kcal/mol。其中山奈酚与IL6、槲皮素与IL6、槲皮素与AKT1结合效果最佳。研究发现血管内皮生长因子A（VEGFA）的尿排泄与肾损伤出现蛋白尿相关[46]。VEGF可抑制肾小球炎症，并加速肾小球功能恢复[47]。LIU T等[48]通过实验验证了，中药能通过抑制IL-6、TNF-α、AKT1表达，并激活VEGFA的表达，保护肾小球系膜细胞免受脂多糖诱导的炎症损伤。因此，核心方治疗CGN的机制可能与之相关，可通过进一步实验验证。

综上所述，王孟庸治疗CGN的核心方由黄芪、女贞子、墨旱莲、熟地黄、当归、黄精、白芍、白术、茯苓、陈皮、牡丹皮组成。核心方治疗CGN的关键靶点有TNF、AKT1、IL6、VEGFA等，主要通路有PI3K/AKT 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、MAPK信号通路。本研究可为后期作用机制研究提供参考。