谷氨酰胺代谢调控慢性肝病作用机制的研究进展

江周影，梁诗雨，赵铁建，王佳慧，郑 洋

1 广西中医药大学基础医学院生理教研室，广西南宁 530222；2 广西中医药大学赛恩斯新医药学院医学系，广西南宁 530222

慢性肝病(chronic liver disease，CLD)指迁延6 个月以上不愈的各类肝病，由病因可分为肝炎病毒感染性肝病、酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、药物或化学毒物性肝病等，如果上述病因持续存在，进一步发展会导致肝纤维化(liver fibrosis，LF)、肝硬化(liver cirrhosis，LC)和原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)，给慢性肝病患者的生活质量带来消极影响[1]。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是碳和氮的来源，可以合成氨基酸、蛋白质、核苷酸和脂肪酸等生物大分子，也是人体内含量最丰富的非必需氨基酸。谷氨酰胺在“Warburg”效应中的地位已经确定，对肝癌的促生长作用也已经有大量实验佐证，最近的研究表明调控谷氨酰胺代谢还能通过抗炎、抗氧化、改善肠道微环境、能量代谢等作用调控CLD 的进展[2-5]。谷氨酰胺进入细胞后在谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)作用下脱氨基转变为谷氨酸，谷氨酸通过谷氨酸脱氢酶生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，进入三羧酸循环产生能量供机体代谢需要；同时谷氨酰胺是合成谷胱甘肽(glutathione，GSH)的前体物质，参与维持细胞内氧化还原状态的稳态[6]。谷氨酰胺代谢具体的分子路径见图1。本文针对调控谷氨酰胺代谢的分子机制及其对慢性肝病的作用进行综述，为慢性肝病的防治提供新的靶标。

图1 谷氨酰胺转运及其在细胞内代谢的分子路径Fig.1 The molecular pathway of glutamine transport and its metabolism in cells

1 IL-6/STAT3/c-myc 信号通路通过调节谷氨酰胺代谢对慢性肝病的影响

白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)可以上调信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)的含量，进一步增加c-myc 的表达，c-myc 可以通过抑制miR-23 的表达从而上调GLS 的含量调控谷氨酰胺代谢[7-8]。溶质载体家族1 成员5(solute carrier family 1 member 5，SLC1A5)是细胞膜上的谷氨酰胺转运体，其表达受到c-myc 转录的调控，因此c-myc可以通过促进细胞摄取谷氨酰胺调控其代谢，当miR-137 靶向slc1a5 基因表达时，可以抑制黑色素瘤细胞对谷氨酰胺的摄取及其细胞增殖[9-10]。有研究表明用短发夹RNA 沉默口腔鳞状细胞癌中的c-myc 后，癌细胞中c-myc 的水平下降，并通过此效应抑制了谷氨酰胺的代谢和肿瘤的生长[11]。c-myc 的表达与谷氨酰胺代谢相关酶——GLUD1和PSAT1 的mRNA 表达量呈正相关[12-13]，其作为调控谷氨酰胺代谢的关键靶点，可以成为探究细胞代谢分子机制的切入点[14]。目前已知的白藜芦醇、丹皮酮等对此通路有抑制作用[15-16]，使谷氨酰胺代谢减弱。

调控此通路能对LF、ALD 和PHC 产生影响。激活此信号通路能发挥抗炎、抗凋亡的作用，能对LF、ALD 起治疗效果，并能够预防PHC的发生。LF 是炎症刺激及肝细胞坏死导致肝内纤维结缔组织异常增生的一个病理生理过程[17]，而ALD 的病因主要是酗酒导致的肠道屏障完整性的破坏及继发的炎症反应。激活此通路能促进谷氨酰胺的摄入和α-KG 的生成。有研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体δ 的激动剂GW501516 能上调SLC1A5 蛋白的水平，增加谷氨酰胺的摄取并通过此效应抑制炎症反应[18]；而在敲除了转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的小鼠体内，SLC1A5 表达量的下降介导了炎症反应的发生 [19] 。且谷氨酰胺的代谢产物α-KG是组蛋白去甲基化酶JMJD3 的底物，增强谷氨酰胺代谢可以促进组蛋白H3K27 去甲基化，从而激活M2 相关基因，起到抗炎作用[20]。此外，增加外源性谷氨酰胺的摄入也能起到抗炎作用。谷氨酰胺能下调核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) p65 蛋白的表达，抑制下游NLRP3 炎症小体的活化[21-22]。在酒精性肝病的进展中，增加Gln 摄入更是可以上调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的水平，防止人克隆结肠癌细胞单层的紧密连接被破坏，也可以保护长期乙醇喂养的大鼠结肠上皮的紧密连接相关蛋白，阻止内毒素易位及其与肝巨噬细胞表面的toll 样受体4 的结合，阻止IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎症因子的产生[23-25]。肝细胞过度凋亡可以诱导细胞代偿性增殖，进而导致肿瘤的发生[26]。IL-6/STAT3/c-myc 信号通路的激活能够增加谷氨酰胺分解代谢，对PHC 具有一定的预防作用。谷氨酰胺的代谢产物之一——GSH 具有抗氧化功能，可以避免肝细胞的凋亡，而乳酸脱氢酶、丙二醛等则是凋亡标志物[27-28]。在力竭大鼠模型中，发现谷氨酰胺干预组的血清中乳酸脱氢酶、丙二醛和乳酸水平显著降低，而GSH 和超氧化物歧化酶水平显著提高[29]。此外，谷氨酰胺也可以通过上调Bcl-2 水平和下调Bax 水平抑制肝细胞凋亡。Bcl-2蛋白具有很强的抗凋亡作用，而Bax 蛋白具有诱导凋亡效应，有研究认为细胞内Bcl-2 与Bax 的比率是决定细胞凋亡的关键[30-31]。补充谷氨酰胺后，肝组织中的Bax 基因表达水平显著降低，而Bcl-2 基因表达水平显著增高[29]。而在已发生PHC的患者体内，抑制此信号通路能通过抑制GSH 的生成促进肝癌细胞的凋亡，从而起到控制疾病发展的作用。

2 PI3K/AKT/mTOR 信号通路通过调节谷氨酰胺代谢对慢性肝病的影响

细胞内的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)的水平上升后，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)水平随之升高。哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)复合体1 是AKT 的标靶，其合成增加能促进c-myc 的翻译，也能通过增加糖原合成酶激酶-3和FOXO3A 的合成抑制c-myc 的降解[32]。PI3K/AKT/mTOR 通路激活后可以上调c-myc 的表达，增加谷氨酰胺代谢相关酶的表达，促进谷氨酰胺代谢。此通路通过靶向c-myc 调控谷氨酰胺代谢，故对LF、ALD 和PHC 产生的影响及途径与IL-6/STAT3/c-myc 信号通路相似。激活此信号通路产生的作用与上述IL-6/STAT3/c-myc 信号通路基本一致，值得注意的是，c-myc 表达增加后，谷氨酰胺的摄入随之增加，并反馈抑制PI3K/Akt 通路下调 mTOR 蛋白的表达，促进自噬反应起到一定的炎症抑制效果[33-34]。抑制此信号通路能对PHC 和NAFLD 起治疗作用。NAFLD 是一类以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其导致的肝硬化[35]。NAFLD 的病因主要有两点：三酰甘油和葡萄糖的过量积累，及其导致的脂肪从头合成增加和脂蛋白颗粒的形成改变；线粒体内脂肪酸氧化减少和过氧化物酶体内脂肪酸氧化增加，导致氧化应激和内质网应激，从而使肝细胞发生炎症反应、损伤和坏死[36]。此信号通路靶向蛋白GLS。研究表明GLS1 的mRNA 水平不仅在肝癌患者体内升高，也在NASH 患者肝细胞中特异性上升，沉默肝的Gls1 能治疗NASH[37-38]。异常代谢的极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)是导致NASH 发生的原因之一[39]，沉默Gls1 可以改善VLDL 的运出，恢复其分泌，减轻肝脂肪变性；同时，沉默Gls1 可以显著降低其介导的原代肝细胞和体内NASH 模型的氧化应激，恢复肝内磷脂的含量，有利于VLDL 的合成[37]。在NAFLD 大鼠模型中，参苓白术散能使肝细胞内mTORC1、STAT3 的mRNA 及相应蛋白表达下调，从而对NAFLD 起到一定的防治效果[40]。mTORC1 及STAT3 分别与PI3K/AKT/mTOR 信号通路、IL-6/ STAT3/c-myc 信号通路相关，参苓白术散的治疗机制可能与抑制这两种信号通路，继而下调GLS1 的含量有关。此外，外源性L-鸟氨酸-L-天冬氨酸(l-ornithine l-aspartate，LOLA)的摄入能增加体内谷氨酰胺含量，促进GSH 的生成，对NAFLD 也起一定的治疗作用[41]。而在PHC 的治疗上，抑制此通路的药物已经成为不可或缺的临床用药。在原发性肝癌患者体内，谷氨酰胺可以作为肝癌细胞的重要代谢原料而存在。示踪实验显示，癌细胞合成的蛋白质中一半的非必需氨基酸可以来源于谷氨酰胺[42]。同时，癌细胞可以依靠谷氨酰胺氧化磷酸化进入三羧酸循环供能，且对其有“代谢依赖”[43]。肝癌细胞中PI3K/AKT通路常异常激活，导致谷氨酰胺代谢异常活跃，此效应能促进肝癌细胞的生长，而沉默HIF-1α 可以抑制PI3K/AKT 通路，从而抑制肝癌细胞的增殖[44]。依维莫司、西罗莫司等药物可以作为PI3K/AKT/mTOR 信号通路的抑制剂抑制谷氨酰胺代谢，协助多种肿瘤治疗[45]。此外有研究表明，在缺乏谷氨酰胺的细胞培养基中肝癌细胞不易生长，而在谷氨酰胺浓度高的培养基中培养，肝癌细胞的侵袭能力增强[46]。NAFLD 的发展与GLS1相关，而PHC 的发展与谷氨酰胺代谢密切关联，此通路可以通过影响GLS1 的表达和谷氨酰胺代谢影响慢性肝病的病程。

3 ERK/NGFI-B/GLS1 和Hedgehog-YAP 信号通路通过调节谷氨酰胺代谢对肝纤维化的影响

谷氨酰胺的代谢产物之一——α-KG，可以使细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化，进而促进核受体神经生长因子诱导的基因B (nerve growthfactor-induced gene B，NGFI-B)的磷酸化，导致NGFI-B 出核，进一步下调Gls1 启动子的甲基化，增加GLS1 的生成，形成了ERK 与谷氨酰胺代谢之间的正反馈回路[47]。Yes 相关蛋白(yes associated protein，YAP)是Hedgehog 信号通路(hedgehog signaling pathway，Hh)的下游效应物，能与相关的转录调节因子TAZ合作，调节具有TEAD 结合位点的基因表达，序列分析提示GLS1 基因启动子区域存在TEAD 结合位点[48]。YAP 可以通过TEAD 结合位点上调肝星状细胞中GLS1 的表达[49]。

抑制ERK/NGFI-B/DNMT3b 和 Hedgehog-YAP信号通路能够抑制谷氨酰胺代谢，减少代谢过程中产生的ATP。在肝纤维化进程中，肝星状细胞转化为肌成纤维细胞这一步骤极其重要，而这一步骤需要的能量超出了葡萄糖氧化供能的极限，谷氨酰胺代谢在肝星状细胞转分化的过程发挥重要的作用，其提供ATP、核酸、氨基酸、脂质等物质，为肌成纤维细胞的生成提供能量以及合成代谢原料[49]。Hedgehog-YAP 信号通路的激活可以通过促进谷氨酰胺代谢增加腺嘌呤核苷三磷酸的生成，促进肌成纤维细胞的生成，而抑制谷氨酰胺代谢可以在急性肝损伤期减少肌成纤维细胞的积累[50-51]。维替泊芬是Hedgehog-YAP 信号通路的抑制剂，其能通过抑制YAP 与TEAD 的结合，降低细胞GLS1 的含量，抑制谷氨酰胺代谢及肝纤维化[52-53]。大黄素是ERK/NGFI-B/DNMT3b 信号通路的抑制剂，其能促进核受体NGFI-B 与DNA甲基化酶DNMT3b 相互作用，使Gls1 启动子甲基化，抑制谷氨酰胺代谢，促使肝星状细胞衰老，从而抑制其转分化，起到治疗肝纤维化的作用[47]。

4 APC/C-Cdh1 信号通路通过泛素化介导谷氨酰胺酶失活及其对慢性肝病的影响

激活蛋白上皮型钙黏蛋白(cadherin-1，Cdh1)可以与后期促进复合物/细胞周期体 (anaphasepromoting complex/cyclosome，APC/C)连接构成一个蛋白复合体，此复合体可以通过识别特定基序——KEN 盒，介导蛋白质从泛素化途径降解[54]。目前已发现的GLS 的两种亚型——GLS1(肾型)和 GLS2(肝型)，在基因序列上都具有KEN盒基序，这导致它们可以被APC/C-Cdh1 识别成为其的底物[55]。APC/C-Cdh1 可以通过泛素化将GLS降解，抑制谷氨酰胺的代谢，故而此通路的激活可以减少GSH 和ATP 的生成。若能特异性激活体内的APC/C-Cdh1 信号通路，则可以抑制PHC 和LF 的发展，或许对NAFLD 的病程也有一定影响。目前已有实验报道，Cdh1 可破坏并降低苯丙氨酸羟化酶的半衰期，相反，CRISPR/Cas9 介导的Cdh1 敲除能稳定苯丙氨酸羟化酶的表达并增强苯丙氨酸代谢。而苯丙氨酸羟化酶是PHC 的预后标志物，Cdh1 可能是调节苯丙氨酸羟化酶介导的生理和代谢紊乱的潜在治疗靶点[56]。此外，APC/C-CDH1 能通过促进富马酰乙酰乙酸水解酶的泛素化作为其负稳定剂，降低富马酰乙酰乙酸水解酶的半衰期，而在肝癌组织中的此蛋白水平显著升高。但此通路对谷氨酰胺代谢的影响仍缺少实验结果佐证。

5 结语

慢性肝病是一种以肝功能受损为主要表现的慢性病理性过程。根据已有的研究，谷氨酰胺代谢是慢性肝病中重要代谢途径。本文综述了IL-6/STAT3/c-myc 信号通路、PI3K/AKT/mTOR 信号通路、ERK/NGFI-B/GLS1 信号通路、Hedgehog-YAP信号通路、APC/C-Cdh1 信号通路对谷氨酰胺代谢的调节作用，也总结了谷氨酰胺代谢通过增加谷氨酰胺的摄入和GSH、α-KG 等物质的生成所发挥的抗炎、抗氧化、抗凋亡、保护肠道黏膜及提供能量的作用(图2)。目前对于谷氨酰胺代谢的作用及调控机制仍需要进一步研究来阐述其与慢性肝病之间的联系，以期基于谷氨酰胺代谢开发更多的药物来治疗慢性肝病。

图2 谷氨酰胺代谢对慢性肝病的影响Fig.2 The impact of glutamine metabolism on chronic liver diseases

作者贡献江周影：文章总体构思，相关文献的查阅及阅读，撰写初稿；郑洋：策划写作思路及写作目的，指导文章撰写，文章审读及修订，申请获取项目基金和出版基金资助；梁诗雨：提出文献修订建议及意见；赵铁建：文章修订；王佳慧：提出文章写作思路，文章后期修订。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。