基于GFP发光机理构建非共轭胺与环烷基醇胶束荧光体系

兰 帅， 张 雨， 杜威龙， 贾丹丹， 曹 磊， 王东军

（1. 河北科技师范学院化学工程学院； 2. 分析测试中心, 秦皇岛 066004）

绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）因其独特的光学性质而备受关注， 并在分子生物学、细胞生物学和医药学等领域有着广泛的应用［1～12］. GFP 通过有规则的分子内氢键作用，β-折叠形成了β-筒状结构， 且α-螺旋恰好位于这个筒状结构的两端， 形成了一个接近完美的圆柱体结构（“β-can”结构）， 使得GFP获得了结构稳定性［13～20］. 值得注意的是， 大多数GFP的核心生色团是非共轭基团， 只有位于β-筒状结构的中心才能发出强烈的绿色荧光（“Light in a can”）， 而位于β-筒外的则是非发光基团，这说明GFP发光是基于一种特殊的核-壳结构［21～23］.

近年来， 科学家尝试通过化学方法合成并模拟GFP功能结构［24～30］. 但由于制备的生色团缺乏类似β-筒状结构的保护与限制， 导致其无法获得高荧光性能的体系［31～34］. 因此， 探究新的制备手段以构建类似GFP发光结构的化学体系具有非常重要的理论和应用意义.

通过对多种胶束前驱体的筛选， 我们发现环烷基醇类化合物形成的胶束可有效促进并保护非共轭有机胺构建荧光中心. 本文以二乙烯三胺（DETA）与环己基甲醇（CHM）体系为例模拟出类似GFP机理的化学发光体系（图1）， 研究了浓度、 温度、 陈化时间等因素对于荧光性能的影响. 同时， 通过几种环烷基醇类化合物的对比实验发现， 胶束结构的微小改变可显著影响体系的发光能力. 最后， 基于此类荧光体系的温度敏感特性， 研究了其应用于温度传感器的可行性.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙二胺、 二乙烯三胺、 三乙烯四胺、 四乙烯五胺、 聚乙烯亚胺、 环己基甲醇、 环己烷乙醇、 罗丹明6G和硫酸奎宁均为分析纯， 购自阿拉丁试剂（上海）有限公司. 实验所用试剂均直接使用， 未进行进一步纯化， 实验过程中均使用超纯水.

UV-2600型紫外-可见分光光度计（UV-Vis）， 日本岛津公司； F-7000型荧光分光光度计（Flu）， 日本Hitachi 公司； FLS-920型稳态/瞬态荧光光谱仪（PL）， 英国Edinburgh 公司； SU-8010型扫描电子显微镜（SEM）， 日本Hitachi公司； F-7650型透射电子显微镜（TEM）， 日本Hitachi公司； Avance Ⅲ 600 Hz型核磁共振波谱仪（NMR）， 瑞士Bruker公司； BX51型荧光显微镜（LSCM）， 日本Olympus公司； ZF-1型紫外灯， 上海京工实业有限公司； FA20048型分析天平， 上海佑科仪器仪表有限公司； DZF-6050型真空干燥箱， 上海程造仪器设备有限公司； DHG-9075A型电热鼓风干燥箱， 上海米青科实业有限公司.

1.2 小分子胺/环己基甲醇胶束体系的制备

在10 mL试剂瓶中分别加入不同质量的DETA溶液和CHM溶液， 搅拌均匀， 配制一系列不同浓度（DETA 质量分数0.01%～20%）的样品. 将混合均匀的样品分别于室温和60 ℃条件下进行陈化， 实时观察.

1.3 不同胺类与环己基甲醇体系样品的制备

在10 mL 试剂瓶内分别加入0.05 g 胺（乙二胺、 三乙烯四胺、 四乙烯五胺、 聚乙烯亚胺）和9.95 g环己基甲醇（或环己烷乙醇）， 搅拌均匀， 配制胺质量分数为0.5%的不同样品， 在室温下进行陈化， 实时观察.

2 结果与讨论

2.1 浓度对DETA/CHM体系荧光性质的影响

DETA和CHM均为没有荧光的非共轭结构的前驱体. 将DETA和CHM混合制备出DETA质量分数在0.01%～20%范围内的一系列样品. 各浓度样品刚混合时都没有荧光， 陈化几小时后样品在440 nm处出现荧光发射峰， 激发峰位于约364 nm 处， 并且荧光强度逐渐增强（此变化趋势下文讨论）. 同时，我们发现DETA的含量对荧光强度有决定作用， 如图2（A）和（B）所示. 随着DETA含量的增加， 荧光强度逐渐增强， 当DETA 浓度达到0.5%时， 荧光强度达到最大， 体系量子产率达到60%［35，36］， 高于一般非共轭荧光体系的荧光量子产率. 然而随着DETA浓度的进一步增加， 荧光强度逐渐减弱， 当DETA浓度高于2%时样品荧光逐渐消失. 这是由于DETA分子是极性试剂， 倾向存在于环己基甲醇形成的胶束内部. 当其浓度逐渐增大时， 进入胶束的DETA增加， 使得胶束尺寸增大， 导致限域效应消失， 荧光逐渐消失. 另外， DETA浓度的增加也可能导致荧光体系的微环境变化， 对荧光中心产生影响. 对不同浓度的DETA/CHM 混合-陈化样品进行了UV-Vis吸收测试， 如图2（C）所示， 在364 nm处出现一个明显的吸收峰， 与体系的荧光激发峰值相吻合. 尤其重要的是， DETA浓度为0.5%（即荧光最佳浓度）时的样品具有最大吸收值， 而不是那些DETA浓度更高的样品， 此结果在一定程度上证明了DETA/CHM荧光体系具有特殊结构. 同时， 我们发现吸收强度随浓度的变化趋势与荧光强度的变化趋势一致［图2（B）和（C）中插图］. 由一系列浓度样品在紫外灯365 nm下的照片［图2（D）］可以观察到0.5%样品的荧光强度较强. 为解释上述荧光和吸收的特殊现象， 我们认为体系可能形成了胶束结构， 构建出类似GFP模式的核-壳结构发光体系.

2.2 DETA/CHM体系的TEM和SEM表征

如图3 所示， DETA/CHM 体系在最佳浓度（DETA 质量分数为0.5%）时， 胶束尺寸约为4 nm［图3（A）］. 当DETA浓度高于0.5%时， 胶束的尺寸主要集中在20～100 nm， 并与一些几微米的大胶束共存［图3（B）～（D）］. 此测试结果表明DETA的浓度对胶束的大小起着决定性作用， 低浓度才能出现纳米级胶束. 浓度增大生成大胶束， 荧光逐渐消失， 这一规律和荧光强度的变化相符. 该结果说明环己基甲醇自身形成一种胶束作为保护壳层， 同时为荧光的形成提供了理想的空间， DETA分子作为极性试剂， 倾向于存在于胶束内， 在CHM形成的球形结构内相互聚集， 由于限制效应而形成强烈发射. 胶束内DETA含量增加会使胶束尺寸增大， 导致限制效应消失， 从而荧光消失. 由此可见， 此发光体系在机理和结构等方面与GFP有着极为相近的特征： （1） 壳层具有适当的结构和尺寸， 提供保护层和内部空间； （2） 非共轭基团在壳层内形成高效的荧光中心， 而在壳层外无法发光. 值得注意的是， 只有环烷基醇类前驱体才能形成有效的壳层， 而胺-线性醇类（如正己醇等）体系不具有发光性能（见本文支持信息图S1）.

Fig.3 TEM(A, B) and SEM(C, D) images for the DETA/CHM samples at different concentrations of DETA

2.3 DETA/CHM体系的核磁数据分析

如图4（A）所示， 纯DETA分子1H NMR谱的质子信号范围为δ2.5～2.9. 如图4（B）所示， 纯CHM分子中C原子上H的质子信号范围为δ1.0～5.5， CHM中羟基的质子信号峰出现在δ3.44附近， 与羟基相连C原子上的质子因为受到的屏蔽作用较小， 电子云的密度较低， 信号峰出现在δ5.28附近.

对于DETA/CHM混合后形成的荧光体系， 将其核磁共振波谱图与混合前驱体DETA和CHM的核磁共振波谱图分别进行对比， 并未发现新的质子信号峰， 说明荧光体系的形成过程是物理变化过程， 而非化学变化过程. 对比测试了不同浓度的荧光样品核磁数据［图4（C）］， 其中CHM的核磁信号在不同浓度样品中没有显著变化［图4（C）右侧图］. 但仔细对比不同浓度样品的DETA核磁信号时［图4（C）左侧图］发现， 存在于CHM胶束中的DETA化学位移均比纯DETA的大， 而且核磁峰交叠明显， 随DETA浓度降低上述特征更加明显. 当DETA浓度控制在0.4%～0.5%范围时， 荧光样品的DETA核磁信号交叠在一起. 此结果在一定程度上证实了上文的推测， 即DETA在CHM胶束中的特殊环境形成了特殊的电子云空间共轭［37］.

Fig.4 1H NMR spectra of DETA(A), CHM(B) and their fluorescent mixtures at different concentrations(C) in CDCl3

2.4 陈化时间和温度对DETA/CHM体系荧光性质的影响

配制0.5%DETA/CHM 混合样品， 在室温下进行陈化. 随着陈化时间的延长， 样品的荧光强度逐渐增强， 当陈化时间为6 d 时， 荧光强度达到最强. 同时紫外吸收强度也随着陈化时间的延长而增强［图5（A）～（C）］. 实验结果表明， 胶束荧光中心在室温下的形成是一个缓慢的过程， 而且形成荧光中心需要一定时间， 以达到其最佳空间构型. 基于此， 进一步考察了陈化温度对胶束形成及荧光性能的影响. 将胶束的陈化温度调整为60 ℃， 仅6 h胶束即可获得最大荧光强度， 远低于常温下所需的陈化时间（6 d）. 由此证明适当的陈化温度对荧光体系的形成有利， 可加速形成荧光中心. 同时由图5（D）～（F）可见， 提高陈化温度仅加速了DETA/CHM 体系中荧光中心生色团的形成速率， 并没有改变该体系荧光中心的结构和性质.

Fig.5 Fluorescence(A, D) and UV-Vis(B, E) spectra and relative line chart of fluorescence intensity versus time(C, F) of 0.5% DETA/CHM samples aging at room temperature(A—C) and 60 ℃(D—F)

2.5 胶束壳层微结构变化对荧光体系的影响

本课题组在前期工作中已经合成了DETA/CHA类GFP胶束［38］， 本文在此基础上又合成了二乙烯三胺/环己烷乙醇（DETA/CHE）体系. 由图6（B）中可见， DETA/CHM的荧光强度最强， 远高于其它两个胶束. 随着六元环上碳链的增长， DETA/CHA（λem=456 nm）， DETA/CHM（λem=440）及DETA/CHE（λem=432 nm）胶束的发射波长逐渐蓝移， 如图6（B）和（C）所示. 从激发波长看， DETA/CHA陈化过程中只有两个激发峰［λex=268， 364 nm， 图6（D）］. DETA/CHM最开始在λex=270， 360 mn有两个激发峰， 第七天出现3 个激发峰［λex=280， 336， 384 nm， 图6（E）］. DETA/CHE 同时存在有3 个激发峰［λex=272， 324， 356 nm， 图6（F）］. 上述结果表明， 得到的核-壳型荧光体系的性质不仅取决于构成荧光中心的DETA， 还严重依赖于其存在环境， 胶束前驱体的微小改变会显著影响体系的光学性质.

Fig.6 Comparison of fluorescent properties for the three systems prepared with DETA and CHA,CHM and CHE

2.6 不同非共轭胺在CHM胶束中的荧光性能

尝试用不同的非共轭胺： 乙二胺（EDA）、 三乙烯四胺（TETA）、 四乙烯五胺（TEPA）、 聚乙烯亚胺（PEI）代替DETA， 采用该合成路线成功制备出5 种以CHM 为外壳的类GFP 荧光胶束， 通过对比图7（A）发现， DETA/CHM胶束的荧光强度远高于其它胶束. 图7（B）表明， 随着胺分子的增大， 胶束的发射波长发生一定程度的红移. 另外， 对典型荧光胶束DETA/CHM， TETA/CHM， DETA/CHA， DETA/CHE进行了荧光寿命测试［图7（C）］， 典型样品的激发态寿命值列于表1. 可见， 尽管各样品荧光寿命值存在差异， 但差距不明显， 表明此类样品的荧光中心相近.

Table 1 Excited state lifetime values of four typical samples

2.7 温度响应特性的应用研究

相对于基于分子刚性共轭结构的传统共轭发光有机物， 本文制备的胺-胶束结构体系不具备刚性共轭结构， 而是一种相对松散的核-壳型发光体系. 因此可推测这种特殊的荧光体系的发光性能与传统的有机荧光物质有着显著区别. 如图8（A）所示， 随着温度的升高， DETA/CHM体系在440 nm处的荧光峰呈现减弱的趋势， 在0～90 ℃温度范围内荧光强度减弱了76%， 表明其比传统的荧光物质罗丹明6G和硫酸奎宁具有更高的温度敏感性［图8（B）， 图S2， 见本文支持信息］. 同时， 荧光强度与温度呈线性关系， 随着温度的升高逐渐减弱. 这可能是由于胶束相对体积较大、 结构松散， 温度的升高增加了胶束结构的振动和变形， 破坏了其内部胺分子形成的荧光中心， 导致荧光强度成倍下降. 冷-热循环实验结果表明， 5 次平行实验中， 这些光谱变化过程具有良好的可逆性［图8（C）］. 这进一步表明DETA/CHM胶束体系在温度传感器方面有广泛的应用潜力.

Fig.8 Temperature response emission characteristics of DETA/CHM recorded between 0 and 90 ℃(λex=364 nm; measured with 10 ℃ temperature interval)

3 结 论

模拟GFP发光机理， 以DETA（二乙烯三胺）和CHM（环己甲醇）为前驱体， 通过简单的混合-陈化步骤， 得到了具有较高荧光效率的核-壳型化学荧光体系. 实验探究了浓度、 胶束尺寸、 陈化时间和温度等因素对体系荧光性能的影响， 同时对比了不同环烷基醇化合物形成的荧光胶束， 发现此类荧光体系决定于环境胶束诱导发光， 为研究该体系的发光机理提供了数据支撑. 由于该胶束体系良好的温度敏感性， 在温度传感器等方面具有应用潜力.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20230096.