茯苓酸通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡改善阿尔茨海默病大鼠认知障碍的研究

樊赟，窦润鹏，胡久略，侯紫君，周春祥*

1.210046 江苏省南京市，南京中医药大学

2.473000 河南省南阳市中心医院

3.473000 河南省南阳市，南阳理工学院张仲景国医国药学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室

1 材料与方法

1.1 实验时间

2022年1—9月。

1.2 实验动物

6～8周龄雄性SPF级SD大鼠75只，体质量（200±20）g，购自广东维通利华实验动物技术有限公司，生产许可：SCXK（粤）2022-0063。

1.3 主要药品和试剂

PA（购自四川恒诚致远生物科技有限公司，货号：N1629）；淀粉样β蛋白片段25-35（Aβ25-35）（购自美国sigma公司，货号：A4559）；尼氏（Nissl）染色液（货号：C0117）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（货号：S0131S）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（货号：S0053）购自碧云天生物科技有限公司；亚铁离子（Fe2+）含量检测试剂盒（货号：BC5415）、普鲁士蓝染色试剂盒（核固红法）（货号：G1422）购自索莱宝生物科技有限公司；Alexa Fluor® 647荧光标记神经元核抗原（NeuN）抗体（货号：ab190565）、GPX4（货号：ab219592）、Alexa Fluor® 488标记的羊抗兔IgG（货号：ab150081）、Nrf2（货号：ab31163）、SLC7A11（货号：ab175186）抗体购自Abcam公司。

1.4 主要仪器

Morris水迷宫（型号WMT-100S，成都泰盟软件有限公司）；荧光显微镜（型号BX53，日本Olympus公司）；电泳仪（型号DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）；凝胶成像仪（型号Gel Doc EZ，美国BIO-RAD公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 采用随机数字表法将大鼠分为对照组（Control组）、AD模型组（Model组）、PA治疗组（PA组），PA+Nrf2抑制剂组（PA+ML385组），每组15只大鼠。

1.5.2 造模与给药：参考文献［8］的方法制备AD大鼠模型，除Control组外，其余组大鼠双侧海马缓慢注射5 μL Aβ25-35（浓度2 g/L），Control组双侧海马注射等量0.9%氯化钠溶液，给药7 d后进行Morris水迷宫实验，其中平均逃避潜伏期较Control组大鼠明显延长，平台停留时间及穿越平台次数较正常大鼠明显减少者视为建模成功［9］。造模成功后，PA组腹腔注射50 mg/kg PA［10］，PA+ML385组腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制剂组ML385［5］，Control组与Model组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，PA给药1次/d，ML385给药2次/周，连续给药8周。

1.5.3 末次给药24 h后进行Morris水迷宫实验，水迷宫保持水温25 ℃左右，第1天为适应性训练，第2、4、6天进行定位航行实验，记录大鼠到达平台的时间（逃避潜伏期），第7天移走平台，记录大鼠在120 s内滞留平台时间和穿越平台次数。

1.5.4 各组随机选取5只大鼠，断头处死后取出海马组织，10%甲醛固定，脱水包埋，切成4 μm的切片，Nissl染色后显微镜下观察神经元病理变化。

经过机构改革后，有工作实体的直属机构由改革前的24个精简为17个，直属工作部门人员减少了19.5%,直属事业单位人员编制减少9.9%，与改革前相比，人员共减少15.2%。

1.5.5 普鲁士蓝染色检测海马组织铁沉积：石蜡切片脱蜡至水后加入普鲁士蓝染液浸染，蒸馏水冲洗，加入核固红染液复染细胞核，常规脱水透明，中性胶封片，显微镜下观察蓝色斑点即为铁沉积。

1.5.6 免疫荧光染色检测海马神经元GPX4表达：另取5只大鼠处死后取海马组织冰冻切片，封闭后加入Alexa Fluor® 647荧光标记NeuN抗体及GPX4抗体，4 ℃孵育过夜，再加入Alexa Fluor® 488标记的羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，加入含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的荧光封片剂封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.5.7 将每组剩余5只大鼠处死后，取出海马组织，按照1∶9加入0.9%氯化钠溶液匀浆后，12 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清，蛋白定量后取一部分上清检测GSH、MDA、Fe2+含量，另一部上清用于蛋白质印迹法（Western blotting）。5，5二硫硝基苯甲酸（DTNB）法检测GSH含量，硫代巴比妥酸（TBA）法检测MDA含量，微量法检测Fe2+含量。

1.5.8 Western blotting检测大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达：取1.5.7上清液，提取30 μg蛋白，经电泳分离转膜、封闭后，加入兔抗鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4抗体稀释液（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，再加HRP-IgG二抗稀释液（1∶1 500），孵育1 h后ECL显色，以β-actin为内参，Image Lab软件分析蛋白表达。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠Morris水迷宫实验结果

4组大鼠逃避潜伏期、平台停留时间、穿越平台次数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组间比较结果显示，末次给药第2、4、6天Model组逃避潜伏期高于Control组、PA组，PA+ML385组高于PA组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Model组平台停留时间、穿越平台次数低于Control组、PA组，PA+ML385组低于PA组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 4组大鼠Morris水迷宫实验结果（±s）Table 1 Results of Morris water maze experiment in the 4 groups of rats

注：Control组=对照组，Model组=AD模型组，PA组=茯苓酸（PA）治疗组，PA+ML385组=PA+核因子E2相关因子2抑制剂组；a表示与Control组比较P＜0.05，b表示与Model组比较P＜0.05，c表示与PA组比较P＜0.05。

分组只数逃避潜伏期（s）平台停留时间（s）穿越平台次数（次）第2天第4天第6天Control组1542.42±6.2525.38±4.6713.32±2.4548.34±4.2315.20±3.42 Model组1576.31±7.13a57.55±6.26a45.63±7.41a23.65±4.14a8.40±2.35a PA组1557.39±6.23b36.47±5.83b27.39±4.69b34.42±3.82b12.33±3.54b PA+ML385组1568.42±7.57c48.35±5.81c34.52±5.88c28.34±4.23c9.27±2.23c F值69.63191.48893.560102.07116.589 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 4组大鼠神经元Nissl染色结果

Control组神经元形态结构正常，尼氏体丰富；Model组神经元坏死严重，细胞核皱缩，尼氏体数目减少；PA组神经元坏死减少，排列紧密且尼氏体增多；PA+ML385组神经元损伤明显加重，尼氏体数目减少，见图1。

图1 4组大鼠神经元Nissl染色结果（×400）Figure 1 Results of Nissl staining of neurons in the 4 groups of rats

2.3 4组大鼠海马组织普鲁士蓝染色结果

Control组未观察到蓝色铁沉积，Model组铁沉积较Control组增加，与Model组比较，PA组铁沉积减少，PA+ML385组较PA组铁沉积增多，见图2。

图2 4组大鼠海马组织普鲁士蓝染色结果（×400）Figure 2 Results of Prussian blue staining in hippocampus of the 4 groups of rats

2.4 4组大鼠免疫荧光染色结果

NeuN为神经元标记物（红色），GPX4标记细胞显示为绿色，Control组绿色荧光增强，表明GPX4强阳性表达，Model组绿色荧光减弱，GPX4阳性细胞减少，PA组细胞绿色荧光较Model组增强，GPX4阳性细胞增多，PA+ML385组较PA组GPX4阳性细胞减少，见图3。

2.5 4组大鼠海马组织GSH、MDA、Fe2+含量比较

4组大鼠GSH、MDA、Fe2+含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组间比较结果显示，Model组GSH低于Control组、PA组，PA+ML385组低于PA组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Model组MDA、Fe2+高于Control组、PA组，PA+ML385组高于PA组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 4组大鼠海马组织GSH、MDA、Fe2+含量比较（±s）Table 2 Comparison of GSH，MDA and Fe2+ contents in hippocampus of the 4 groups of rats

表2 4组大鼠海马组织GSH、MDA、Fe2+含量比较（±s）Table 2 Comparison of GSH，MDA and Fe2+ contents in hippocampus of the 4 groups of rats

注：GSH=谷胱甘肽，MDA=丙二醛，Fe2+=亚铁离子；a表示与Control组比较P＜0.05，b表示与Model组比较P＜0.05，c表示与PA组比较P＜0.05。

Fe2+（μg/g）Control组519.85±3.4313.75±2.6926.21±3.76 Model组55.76±0.97a38.24±5.73a53.41±5.64a PA组514.34±2.78b20.25±3.61b25.26±4.23b PA+ML385组59.42±1.65c27.34±4.52c38.55±3.81c F值32.30829.90644.304 P值＜0.001＜0.001＜0.001组别只数GSH（μmol/g）MDA（μmol/g）

2.6 4组大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达比较

4组大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组间比较结果显示，Model组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低于Control组、PA组，PA+ML385组低于PA组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图4。

表3 4组大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量（±s）Table 3 Relative expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 proteins in hippocampus of rats in the 4 groups of rats

表3 4组大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量（±s）Table 3 Relative expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 proteins in hippocampus of rats in the 4 groups of rats

注：Nrf2=核因子E2相关因子2，SLC7A11=溶质载体家族7A11，GPX4=谷胱甘肽过氧化物酶4；a表示与Control组比较P＜0.05，b表示与Model组比较P＜0.05，c表示与PA组比较P＜0.05。

组别只数Nrf2SLC7A11GPX4 Control组51.21±0.141.05±0.121.13±0.11 Model组50.43±0.05a0.23±0.05a0.19±0.03a PA组50.97±0.10b0.85±0.08b0.57±0.06b PA+ML385组50.72±0.08c0.43±0.05c0.35±0.04c F值58.195109.664185.348 P值＜0.001＜0.001＜0.001

图4 4组大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白Western blotting分析图Figure 4 Western blotting analysis of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 proteins in hippocampus of the 4 groups of rats

3 讨论

AD主要以认知功能障碍为主要临床表现，我国65岁以上AD患者高达900余万，随着老龄化的加重，其发病率呈升高趋势［11］。目前AD的治疗尚无特效药物，只能改善临床症状，寻找安全有效的治疗药物具有重要意义［12］。PA具有抗炎、抗氧化、镇静催眠、降糖等多种药理学作用［13-14］。PANG等［10］的研究显示，PA通过激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，改善大鼠脑缺血再灌注损伤和神经元凋亡，表明PA具有神经保护功能。本研究结果显示，使用PA治疗后AD大鼠逃避潜伏期时间缩短，平台停留时间及穿越平台次数增加，表明PA可有效改善AD大鼠的认知功能障碍，Nissl染色结果显示，PA还可减轻海马神经元病理损伤。

铁参与中枢神经系统重要生物学过程，在体内铁超载可引起铁死亡，铁死亡是一种调节性细胞死亡方式，在神经疾病中神经元的死亡中均可发现铁死亡，铁蛋白抑制剂可保护神经元和恢复认知功能［15］。在AD中，Aβ积累可以诱导内质网应激反应，引起细胞抗氧化剂GSH水平降低，内质网内活性氧增加，GSH是合成GPX4的底物，GPX4是一种细胞内抗氧化酶，其水平降低导致过氧化脂类的积累，促进铁死亡发生［16］。研究显示，抑制铁死亡，可改善缺血再灌注大鼠的认知障碍和神经功能缺损［17］。JIANG等［18］研究显示，PA通过激活Nrf2抑制肾脏铁死亡，上调GPX4、SLC7A11和HO-1的表达，保护小鼠缺血再灌注诱导的急性肾损伤。本研究结果显示，使用PA治疗AD大鼠后，大鼠海马组织铁沉积减少，海马组织GSH水平及GPX4表达显著升高，MDA与Fe2+水平显著降低，提示PA可能通过抑制铁死亡，改善AD大鼠认知障碍与神经损伤。

Nrf2是一种应激诱导转录因子，正常情况下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）蛋白相结合形成复合物，当发生氧化应激时，Nrf2分离进入胞核中启动基因转录，在抗氧化中起关键作用，在脑损伤中，激活Nrf2途径可保护神经细胞抵抗铁死亡［19］。Nrf2作为转录因子可增加SLC7A11和GPX4表达，SLC7A11是一种铁死亡调节剂，是GPX4上游调节因子，激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路可抑制铁死亡，保护氧葡萄糖剥夺/再灌注诱导的神经元损伤［20］。研究显示，柚皮素通过激活Nrf2-GPX4通路，抑制铁死亡，减轻脑出血大鼠脑水肿与血-脑脊液屏障通透性，保护神经损伤［21］。本研究显示，PA可上调AD大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平，提示PA可能通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路，改善AD大鼠认知障碍。本研究还显示，使用Nrf2抑制剂ML385可逆转PA对AD大鼠认知障碍的改善及铁积累的抑制，证明PA通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡，改善AD大鼠认知障碍。

综上所述，PA通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡，改善AD大鼠认知障碍。PA在AD中的作用机制仍需更深入的研究。

作者贡献：樊赟提出主要研究目标，负责研究的构思与设计，研究的实施，撰写论文；窦润鹏、胡久略进行数据收集与整理，统计学处理，图、表的绘制与展示；樊赟、侯紫君进行论文的修订；周春祥负责最终版本修订，对论文负责。

本文无利益冲突。