松墨天牛成虫内生殖系统的形态与发育

陈 瑾, 李 慧, 胡天义, 杨华磊, 危嘉航, 金 林, 郝德君,*

(1. 南京林业大学南方现代协同创新中心, 南京 210037; 2. 全椒县孤山国有林场, 滁州 239500)

昆虫因其强大的生殖力和特殊的生殖适应性成为动物界中种类最多、数量最大、地理分布范围最广的生物类群(Bassetetal., 2012),昆虫的生殖系统是昆虫繁殖后代的器官,其结构和功能是研究昆虫生殖能力和适应性的基础,了解其内生殖系统结构和发育过程是研究昆虫生殖生理的首要条件(Alvesetal., 2006; 张万娜等, 2013)。昆虫的内生殖系统的基本结构相同或相似,雌成虫的内生殖系统主要由卵巢、侧输卵管、中输卵管、受精囊和雌性附腺等组成,雄成虫的内生殖系统主要由精巢管(叶)、输精管、贮精囊、射精管和雄性附腺等组成(嵇保中等, 2014)。然而,不同昆虫种内生殖系统的发育过程有所差异。根据卵巢发育过程中的形态变化特征,可划分为4～6个发育阶段,如鳞翅目甜菜夜蛾Spodopteraexigua卵巢发育划分为卵黄沉积期、成熟待产期、产卵盛期和产卵末期4级(王宪辉等, 2003),桃蛀螟Conogethespunctiferalis卵巢发育分为乳白透明期、卵黄沉积期、成熟待产期、产卵盛期和产卵末期5级(张胜男等, 2021);欧洲玉米螟Ostrinianubilalis卵巢发育则分为无卵黄阶段、卵黄沉积阶段、卵成熟期、产卵前期、产卵高峰期和产卵末期6级(Kuangetal., 2004)。其次,由于发育分级依据的不同,划分的标准也不固定。例如鞘翅目七星瓢虫Coccinellaseptempunctata和小黑瓢虫Delphastuscatalinae的卵巢发育依据卵巢管长度,卵室的有无、数目和长度以及卵黄沉积的情况大致划分为未分化期、生长发育初期、生长发育中期、生长发育后期、成熟产卵前期和成熟产卵期6级(尚玉昌等,1980;刘其全,2010);异色瓢虫Harmoniaaxyridis的卵巢发育则是根据卵室的有无和卵巢沉积情况来划分的,分别是未分化期、生长发育初期、卵黄沉积期和成熟待产期4级(陈洁等, 2015)。天牛科沟胫天牛亚科的眉斑并脊天牛Gleneacantor依据卵巢发育过程中颜色的变化、卵粒的数量和形态特征等,将其卵巢发育分为发育前期(0级)、卵裂前期(Ⅰ级)、卵裂期(Ⅱ)、卵黄沉淀期(Ⅲ级)、产卵盛期(Ⅳ级)、产卵末期(Ⅴ级)和产后衰老期(Ⅵ级)7级(李岳诗, 2015)。

关于雄成虫的内生殖系统发育过程研究不多,鞘翅目雄虫的相关研究暂未见报道,现有的研究以鳞翅目昆虫居多,主要是根据精巢体积大小、颜色变化掌握其发育,如青斑蝶Tirumalalimniace精巢发育被划分为乳白透明期、精子束输送生长期、精子束大量输送成熟期和精子束补充期4级(刘微芬等, 2016);亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis雄虫的精巢体积与交配次数有关,交配1次的雄蛾精巢体积显著大于同期未交配雄蛾的,交配2次的雄蛾精巢明显衰退(冯波等, 2020a)。直翅目蝗虫的精巢随着精母细胞迅速增长和成熟精子数量增加,精巢体积逐渐增大,而交配后则随着精子大量排出精巢体积逐渐缩小(赵卓等, 2008)。

研究昆虫生殖系统的发育在害虫的监测和防控中起着重要的作用,可以通过解剖观察卵巢和精巢的发育程度确定害虫种群的卵巢发育级别(Fengetal., 2003; Fuetal., 2014)、判断产卵的高峰期(王宪辉等, 2003)、推断防治最佳时期和确定种群的繁殖能力(樊茹静等, 2019),进而掌握昆虫的种群动态(齐国君等, 2011; 冯波等, 2020a),目前已经应用于害虫的预测预报和防治中(Kuangetal., 2004)。

松墨天牛Monochamusalternatus是我国南方松林中的一种重要蛀干害虫,也是我国重大检疫性森林病害——松材线虫病的主要媒介昆虫(宁眺等, 2004; 郝德君等, 2008)。松墨天牛成虫羽化出孔后,飞往健康松树选择1-2年生松枝进行补充营养,经过1～2周的取食达到性成熟,雌成虫交配后再选择树势衰弱木产卵,携带松材线虫的松墨天牛成虫在取食和产卵时就会传播至新寄主松树(杨洪等, 2007), 研究显示松墨天牛雌虫一般在出孔13 d内生殖系统发育成熟(嵇保中等, 1999),15-20 d是交配高峰期(牟建军, 2005)。虽然已有学者解剖观察了松墨天牛成虫生殖系统(李天安, 1986; 嵇保中等, 1999; 杨洪, 2006),但是关于其生殖器官的发育过程的解剖观察研究尚未见报道。因此,本研究利用组织解剖技术结合显微拍照,对松墨天牛雌雄成虫内生殖系统的结构及发育过程进行了系统地观察研究,并划分了发育分级,以期为生产实践中监测松墨天牛种群发生动态,掌握松墨天牛成虫对松材线虫的传播规律提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试虫来源与饲养

松墨天牛2龄幼虫采自安徽省池州市松林中的松材线虫病侵染的马尾松疫木,带回实验室后利用人工饲料饲养直至成虫羽化(陈瑞旭等, 2017; 陈宏建等, 2021)。羽化的成虫置于塑料养虫盒(直径12 cm,高5 cm)中,提供1-2年生的马尾松枝条(剥除针叶后用枝剪剪成10 cm长小段)作为食物,放置浸润水的脱脂棉球(直径1.5 cm)进行保湿,每日更换新鲜枝条和棉球(李慧, 2021)。试虫饲养于人工气候箱中,温度为(25±0.5) ℃,相对湿度为70%±5%,光周期设置为12L∶12D。当成虫初羽化后未取食时记为0日龄,补充营养1 d的记为1日龄,依此类推。选择体型大小相近、健康的0-16日龄雌成虫和0-15日龄雄成虫为供试昆虫,每日龄雌、雄成虫各解剖3头;选择12日龄雌成虫和9日龄雄成虫解剖观察内生殖系统形态。

1.2 成虫的内生殖系统解剖观察

用解剖剪先剪除松墨天牛成虫的翅、足和头,置于蜡盘上,在体视显微镜(徕卡)下用昆虫针固定好虫体,喷洒PBS缓冲液(pH 7.4)保持其湿润,再用解剖直镊和弯镊分开胸部和腹部,逐步撕开体壁,用昆虫针挑出内生殖系统,剔除微气管、气管及多余脂肪体,再用PBS缓冲液冲掉杂质,待后续观察描述(李慧等, 2018)。

1.3 拍照和数据采集

将解剖后的内生殖器置于盛有PBS缓冲液的玻璃培养皿中,在体视显微镜(蔡司, zen2软件)下观察并拍照采集图片。利用显微镜自带的XY测量系统,测量每侧最发达的两支卵巢管(不包括端丝)长度和1对精巢的精巢叶长径,如图1所示。

1.4 数据分析

原始数据记录与分析使用Microsoft Office Excel 2019。数据处理软件为IBM SPSS Statistics 20,采用非参数检验中的Kruskal-Walls单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同发育级别的卵巢管长度和精巢管长径的差异显著性进行分析,差异显著性水平均为P<0.05。

2 结果

2.1 松墨天牛雌成虫内生殖系统的基本结构和发育分级

松墨天牛雌成虫内生殖系统结构如图2所示,由1对卵巢、1对侧输卵管、中输卵管、交配囊、受精囊管、受精囊、受精囊腺、生殖腔和产卵器组成。每侧卵巢有12支卵巢管,均集生于卵巢萼上,卵巢萼下部渐细进入侧输卵管,侧输卵管较细长,中输卵管较短。受精囊的着生方式为再出式,交配囊为粗长棒状,受精囊管着生于交配囊基端约1/3处,受精囊管细长,前端近受精囊体处“S”形扭曲;受精囊体“&”形,基端和顶端膨大;受精囊腺从受精囊扭曲部位顶端发出,发达且扭曲(图3)。

图2 松墨天牛雌成虫内生殖系统Fig. 2 Internal reproductive system of female adults of Monochamus alternatus1: 悬带Terminal filament; 2: 端丝Terminal thread; 3: 卵巢管Ovariole; 4: 卵巢萼Ovarian calyx; 5; 侧输卵管Lateral oviduct; 6: 交配囊Copulatory pouch; 7: 受精囊Spermatheca; 8: 受精囊腺Spermathecal gland; 9: 中输卵管Common oviduct; 10: 生殖腔Genital chamber; 11: 泄殖腔Cloaca; 12: 腹针Gastric spiculum; 13: 泄殖孔Cloacal aperture.

图3 松墨天牛雌成虫受精囊和交配囊着生关系Fig. 3 Relationship between spermatheca and copulatory pouch of female adults of Monochamus alternatus1: 交配囊Copulatory pouch; 2: 受精囊管Spermathecal duct; 3: 受精囊Spermatheca; 4: 受精囊腺Spermathecal gland.

雌成虫从初羽化到性成熟,卵巢管随着卵黄沉积的增加逐渐膨大,颜色由半透明发育至黄色,附着的脂肪体由丰富至逐渐减少。根据腹部特征、卵巢管、受精囊腺和脂肪体的形态和颜色把卵巢发育过程划分为4个级别(表1; 图4, 5)。补充营养期的0-3日龄为乳白透明期(Ⅰ级),卵巢管细小透明(图6: A);4-9日龄为卵黄沉积初期(Ⅱ级),卵巢管基部形成第1卵室,呈乳白色(图6: B);10-14日龄为卵黄沉积盛期(Ⅲ级),卵巢管已形成第2卵室(图6: C);15-16日龄为卵成熟待产期(Ⅳ级),部分卵巢管第1卵室已形成成熟卵(图6: D)。第1卵室发育为成熟卵后,由卵巢萼排入侧输卵管中,卵巢管中空萎缩(图6: E, F)。

表1 松墨天牛雌成虫不同发育级别卵巢的特征Table 1 Characteristics of different developmental levels of ovaries of female adults of Monochamus alternatus

图6 松墨天牛雌成虫不同发育状态下的卵巢管Fig. 6 Ovarioles in different developmental states of female adults of Monochamus alternatusA: 仅有原卵区的卵巢管(0-3日龄) Ovarioles with germarium only (0-3-day-old); B: 具有原卵区和第1卵室的卵巢管(4-9日龄) Ovarioles with germarium and the 1st egg chamber (4-9-day-old); C: 已分化出第2卵室的卵巢管(10-14日龄) Ovarioles that have differentiated into the 2nd egg chamber (10-14-day-old); D: 分化出第3卵室的卵巢管,第1卵室已有成熟的卵(15-16日龄) Ovarioles with the differentiated 3rd egg chamber and mature eggs in the 1st egg chamber (15-16-day-old); E: 第1卵室已排过卵的卵巢管Ovarioles of the 1st egg chamber that has been ovulated; F: 排过卵的卵巢管基部萎缩,颜色加深呈黄色Atrophy of the base of the ovarioles in ovulated eggs, with a deepening yellow color.

每侧卵巢有两支先发育的卵巢管,距离其越远则卵巢管发育程度越低。雌成虫卵巢管长度随着卵黄沉积逐渐延伸,不同发育级别的卵巢管长度存在显著差异(P<0.05),卵成熟待产期(Ⅳ级)的卵巢管长度最长(表1)。

2.2 松墨天牛雄成虫内生殖系统的基本结构和发育分级

松墨天牛雄成虫内生殖系统由1对精巢、2对附腺、1对输精管、1对贮精囊、1对射精管、环状器和阳茎组成。每个精巢有2支精巢叶,精巢叶(管)扁球形,相互分离,精巢叶腹面发出短的输出管,输出管顺次着生于输精管前段。每侧具有两支附腺,较短的为第1附腺,较长的为第2附腺。输精管中后部弯曲部分为贮精囊,在成虫发育成熟后,明显膨大弯曲,乳白色;贮精囊下端细缩后与同侧的2支附腺一起汇入射精管前端的萼状部。射精管细长,前部游离交叉后进入环状器,呈螺旋状盘曲,直至外生殖器的内囊(内阳茎)而通向体外(图7)。

图7 松墨天牛雄成虫内生殖系统Fig. 7 Internal reproductive system of male adults of Monochamus alternatus1: 精巢叶(管) Testis; 2: 输精管Vas deferens; 3: 贮精囊Vesicula seminalis; 4: 第1腺管1st accessory gland; 5: 第2腺管2nd accessory gland; 6: 复射精管Ejaculatory duct; 7: 环状器Circulator; 8: 阳茎Aedeagus.

依据精巢管、贮精囊和输精管的颜色和形态把精巢发育过程划分为4个级别(表2;图8)。补充营养期的0-1日龄为乳白透明期(Ⅰ级), 精巢叶小,半透明;2-5日龄为精子形成初期(Ⅱ级),精巢叶中间颜色加深,边缘半透明;6-11日龄为精子形成盛期(Ⅲ级),精巢叶呈白色,边缘半透明;12-15日龄为成熟期(Ⅳ级),精巢叶呈白色。比较不同发育级别的精巢叶,发现乳白透明期(Ⅰ级)和精子生成初期(Ⅱ级)的精巢叶长径存在显著差异(P<0.05),后者明显长于前者;精子形成盛期(Ⅲ级)和成熟期(Ⅳ级)的精巢叶长径存在显著差异(P<0.05),成熟期(Ⅳ级)的精巢叶长径最长。

图8 松墨天牛雄成虫精巢不同发育级别划分Fig. 8 Division of developmental levels of testis of male adults of Monochamus alternatusA: 乳白透明期(Ⅰ级)(0-1日龄)Transparent stage (stage Ⅰ)(0-1-day-old); B: 精子形成初期(Ⅱ级)(2-5日龄)Initial stage of spermiogenesis (stage Ⅱ)(2-5-day-old); C: 精子形成盛期(Ⅲ级)(6-11日龄) Peak period of sperm iogensis (stage Ⅲ)(6-11-day-old); D: 成熟期(Ⅳ级)(12-15日龄)Maturing stage (stage Ⅳ)(12-15-day-old).

3 讨论与结论

本研究表明,松墨天牛雌性内生殖系统发育过程中,受精囊和交配囊的形态和颜色无显著变化,卵巢管和受精囊腺变化最明显;随着卵黄沉积增加,卵巢管逐渐膨大延伸,颜色变为黄色;受精囊腺的色泽和形态逐渐变为淡黄色、饱满状(图4, 5; 表1)。松墨天牛雄性内生殖系统发育过程中,精巢叶和贮精囊形态颜色变化明显, 逐渐变为白色、饱满状,精巢叶长径增长,雄性附腺逐渐呈透明、饱满状。雄虫内生殖系统发育速度较雌虫更快,到性成熟所需时间更短(图8; 表2)。

鞘翅目昆虫雌成虫内生殖器由卵巢、侧输卵管、中输卵管和生殖腔等组成,中输卵管末端与生殖腔连接,生殖腔通过生殖孔开口于体外。部分昆虫生殖腔前部分化出交配囊,形态变化多样,受精囊常开口于生殖腔或交配囊前端,受精囊多有附腺(嵇保中等, 2014)。小蠹科昆虫的卵巢有4根卵巢管(左右各2根),但是不同属小蠹的贮精囊和附腺的形态、位置和发育程度存在变化,例如咖啡果小蠹Hypothenemushampei附腺为乳白色丝瓜状,贮精囊管状;黄杉大小蠹Dendroctonuspseudotsugae和华山松大小蠹D.armandi受精囊在产卵期为乳白色球状(刘金林等, 2019)。根据解剖结构、羽化天数及体内其他部分的特征,小蠹科昆虫卵巢发育常划分为透明期(Ⅰ级)、延伸期(Ⅱ级)、卵黄沉积前期(Ⅲ级)、卵黄沉积期(Ⅳ级)和产卵期(Ⅴ级)5个级别(刘金林等, 2019)。

松墨天牛雌虫内生殖系统与其他天牛的结构基本一致,受精囊着生方式为再出式。受精囊附近受精囊管简单,受精囊腺无分支,交配囊基本型式为棒状(李天安, 1986; 嵇保中等, 2014)。交配囊是作为交配时接受阳茎的内囊,受精囊体具有贮存精液的功能,受精囊腺提供精子滋养物质,保持精子活力(嵇保中等, 2014)。松墨天牛初羽化雌成虫已形成完整形态的内生殖系统,卵巢管纤细透明,脂肪体丰富,在补充营养期间卵巢逐渐发育成熟(图4)。参照嵇保中等(1999)和李岳诗(2015)研究结果,根据腹部特征、卵巢管和受精囊腺形态及颜色、脂肪体形态将松墨天牛的卵巢发育划分为4个级别。对比早期研究,本研究发现松墨天牛雌成虫的受精囊腺在卵巢发育过程中变化明显,乳白透明期(Ⅰ级)时白色半透明到卵成熟待产期(Ⅳ级)时淡黄色饱满,而受精囊体和交配囊形态无变化(图5),说明松墨天牛雌成虫在未性成熟时期已初步具备交配能力;卵成熟待产期(Ⅳ级)时受精囊腺饱满、内容物充盈,说明此时受精囊腺发育完全,功能完善(表1; 图5)。本研究观察的松墨天牛卵巢发育过程与嵇保中等(1999)的研究结果一致,并在此基础上补充了交配囊、受精囊体和受精囊腺的形态变化。由于松墨天牛雌虫产卵期较长,未解剖观察到产卵末期内生殖系统的形态,后期有待进一步的观察。

不同昆虫的精巢发育过程中,随着精子的不断积累,附腺、精巢和贮精囊等的颜色变化不同。例如半翅目网蝽科菊方翅网蝽Corythuchamarmorata雄成虫内生殖系统发育过程中,精囊和附腺长度随虫龄增加而显著增长,精囊由不透明色转为乳白色,附腺的颜色从透明变为粉红色(夏振洲和李传仁, 2019)。青斑蝶雄性内生殖系统发育过程中,贮精囊和复射精管随着日龄增加逐渐呈现乳白色,附腺中逐渐积累白色分泌物,精巢颜色加深呈鲜红色,脂肪细胞从Ⅰ级乳白透明期的饱满、乳白色、圆形或长圆形到Ⅳ级精子束补充期的淡黄色丝状。而本研究发现松墨天牛雄性内生殖系统发育过程中精巢、贮精囊、环状器均从半透明到乳白色。随着精巢中精子的不断形成,首先通过输精管释放到贮精囊,最后通过射精管积累到环状器中,因此,精巢、贮精囊、环状器颜色在精巢发育过程中较为明显。

松墨天牛雄性内生殖系统的发育速度明显快于雌性,进入下一发育级别的时间更早,雌成虫12日龄时还处于Ⅲ级,卵巢管第1卵室还未见成熟的卵 (图4; 表1),而雄成虫在12日龄以后均已性成熟,精子束在贮精囊和环状器中大量积累(图8; 表2)。雌雄内生殖器发育不同步现象在其他昆虫中也有报道。例如蝗虫雄虫可以通过与雌虫交尾甚至抱握活动加快卵巢发育速度;其次,通过交配,成熟精子进入雌性体内贮存于受精囊中会等待成熟卵子形成后完成受精(赵卓等, 2008)。在雌性内生殖系统发育过程中,交配囊和受精囊在初羽化时期已经形成,表明松墨天牛雌成虫确实在性未成熟时期具备交配能力。关于松墨天牛雌成虫是否可以通过抱对和交配促进卵巢发育有待进一步探究。本研究所用试虫均为未交配成虫,交配后的松墨天牛雌雄成虫内生殖系统的变化也有待后续的观察。

卵巢发育分级对害虫发生预测具有重要意义,能够预测发生量、发生期以及产卵高峰,对精巢发育进行分级也可以提高预测的准确性。例如梨小食心虫Grapholitamolesta的产卵量与处于卵成熟期的成虫比例存在正相关,雄虫交配前后射精管的形态颜色变化有助于提高预测最佳防治期的准确性(Zhangetal., 2017)。可通过解剖观察亚洲玉米螟O.furnacalis雄成虫的单射精管内含物形态鉴别其交配状态(冯波等, 2020b)。白背飞虱Sogatellafurcifera和褐飞虱Nilaparvatalugens在野外诱捕后解剖观察发现,迁飞高峰期的大部分雌虫卵巢发育处于Ⅱ级,迁出高峰期的大部分雌虫卵巢发育处于Ⅰ级,因此,依据其迁飞时卵巢发育状态可预测发生规律和发生量(Zhengetal., 2014)。

松墨天牛作为松林中的蛀干害虫和松材线虫病的主要媒介昆虫,划分卵巢与精巢发育分级也对预测其发生量、发生期以及最佳防治期具有重要意义。松墨天牛成虫羽化初期传播松材线虫数量最低,一周后传播松材线虫数量迅速上升,主要集中在羽化后7-12 d传播松材线虫,在天牛羽化后12和24 d出现传播松材线虫的两次高峰(王洋等, 2019)。结合嵇保中等(1999)的研究和本研究中松墨天牛内生殖系统发育分级,发现羽化后7-12 d天牛体壁硬化,内生殖系统快速发育,可以推测成虫在卵黄沉积期和精子形成盛期传播松材线虫数量迅速上升,在成熟期达到第1个高峰,可能与成虫卵巢和精巢发育需要取食补充大量营养和雌虫在此时具备产卵能力有关,尚需后续研究验证。