清热养阴除湿丸对痛风大鼠炎症因子及关节功能的影响

张 硕,温 博

(首都医科大学附属北京中医医院,北京100010)

痛风是一种代谢性疾病,主要由于体内尿酸生成过多或排泄障碍导致尿酸盐沉积在关节和软组织中,导致关节炎、痛风石形成[1]。痛风在全球范围内发病率较高,造成较高的社会经济负担。痛风发生机制复杂,炎症反应是最关键的调控机制之一[2],关键炎症调节因子包括半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等。这些因子过度产生和活化会进一步加剧关节组织的炎症反应,诱发关节组织损伤、病理改变[3-4]。NLRP3炎症小体是一个多蛋白复合物,由NOD样受体蛋白3(NOD like receptor protein 3,NLRP3)、ASC适配蛋白、Caspase-1组成[5]。当尿酸结晶或其他炎症刺激物存在时,NLRP3炎症小体被激活并形成,进而促进Caspase-1活化和IL-1β产生。IL-1β作为重要的炎症细胞因子,能诱导炎症反应进一步发展,参与细胞凋亡、炎症细胞迁移等过程[6]。清热养阴除湿丸是我院经典的院内制剂,主要包括白花蛇舌草、虎杖、白鲜皮、金银花、连翘、土茯苓、防己、牡丹皮、赤芍等,常用于治疗湿热病症,如湿热痛风[7]。中医理论认为,湿热是湿邪与热邪结合造成的病理状态,清热养阴除湿丸通过清热解毒、养阴凉血、除湿等改善痛风症状[8]。然而,关于清热养阴除湿丸抗痛风效应的具体靶点尚不明确。本研究旨在探讨清热养阴除湿丸对痛风的治疗机制,着重观察其对NLRP3炎症小体的影响,为临床深入理解痛风的发病机制及清热养阴除湿丸的科学应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:50只6～8周龄SPF级雄性SD大鼠,体重180～210 g,实验动物生产许可证号[SCXK(沪)2008-0016]。实验环境温度20～23 ℃、湿度50%～65%,每日12 h光暗周期,自由采食、饮水。动物饲养以及实验均符合首都医科大学伦理规定,伦理批准号2020A112。

1.1.2 主要试剂:尿酸钠(批号BCBW1849,美国Sigma公司);秋水仙碱(批号H53021389,昆药集团股份有限公司);清热养阴除湿丸(批号Z20053306,首都医科大学附属北京中医医院)。一抗NLRP3(货号15101)、Caspase-1(货号24232)、IL-1β(货号12703)、LC3B(货号3868)、p62(货号48768)、PHB2(货号E1Z5A)、GAPDH(货号92310)均购于Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 主要仪器:脱水机(型号Donatello,泰普生物科学有限公司);包埋机(型号JB-P5,武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(型号 RM2016,上海徕卡仪器有限公司);酶标检测仪(型号Epoch,美国Bio TeK公司);荧光定量PCR仪(型号CFX,美国 Bio-rad 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 改良Coderre 法构建痛风模型:适应性喂养1周后进行实验。大鼠分笼饲养,每笼至多5只大鼠。采用随机数字表法将50只大鼠分为空白组、模型组、秋水仙碱组、清热养阴除湿低剂量组、清热养阴除湿高剂量组。空白组:麻醉成功后,将6号注射针在大鼠右侧踝关节后侧沿跟腱内侧以30°～40°方向插入至关节腔,向大鼠右踝关节注入0.9%氯化钠溶液50 μl,连续注射3 d;其余四组大鼠均采用改良Coderre 法构建痛风大鼠模型,手术操作同前,但向大鼠右踝关节注入50 μl浓度为25 g/L尿酸钠混悬液。

1.2.2 干预方法:造模完成后,进行药物干预治疗。空白组、模型组大鼠每日灌胃0.9%氯化钠溶液5 ml;秋水仙碱组大鼠按6×10-4g/kg灌胃秋水仙碱混悬液,5 ml/次,2次/d,连续灌胃7 d;清热养阴除湿低剂量组和高剂量组分别按3.2、6.4 g/kg标准给大鼠灌胃清热养阴除湿丸混悬液,5 ml/次,2次/d,连续灌胃7 d。

1.2.3 关节肿胀指数及步态评分:参照沈瑞明等[9]方法对大鼠关节肿胀指数、步态评分进行评估。踝关节肿胀指数:造模前、造模后48、72 h,采用缚线法测量右踝关节同一部位周径;踝关节肿胀指数=[(造模后/造模前)右踝关节周径]×100%。步态评分:分别于造模后48、72 h观察大鼠步态、行为表现确定步态评分;0分为双足正常行走,1分为轻度跛行且右下肢可着地但略带弯曲;2分为中度跛行且右下肢可着地但立刻收回;3分为重度跛行且右下肢不能着地。

1.2.4 HE染色:大鼠滑膜组织经4%多聚甲醛固定后,梯度浓度乙醇脱水,石蜡包埋。将组织块切成5 μm厚片,依次进行苏木精-伊红染色、乙醇脱水,再经二甲苯透明,滴加树胶、封片,光镜下观察滑膜组织病理改变。

1.2.5 ELISA检测:处死大鼠后取无菌腹主动脉血,采用高灵敏度ELISA试剂盒检测大鼠外周血中IL-1β、IL-18、IL-33、TNF-α含量。在试剂盒孔板中加入100 μl血清,孵育和洗涤后加入按1∶100稀释后的IL-1β、IL-18、IL-33、TNF-α;洗涤后每孔加入100 μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(1∶100);洗涤后每孔加100 μl生色底物TMB,暗室中孵育10 min,每孔加100 μl终止液;用酶标仪检测450、570 nm的OD值。

1.2.6 RT-qPCR检测:使用Trizol试剂分离,提取静脉血总RNA后进行反转录,检测相应目的基因表达。扩增反应条件为:95 ℃预变性10 min,循环40次(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s),以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt方法计算mRNA相对表达量。基因引物序列,见表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting检测:将大鼠滑膜组织置于冰上加入裂解液进行裂解,提取总蛋白并定量。以40 μg蛋白/孔的标准进行电泳,电泳后转移到聚偏二氟乙烯膜上,用牛血清白蛋白溶液封闭,与抗NLRP3、Caspase-1、IL-1β、LC3B、p62、PHB2的一抗共同孵育,在4 ℃条件下孵育过夜;用TBST洗膜3次,与二抗孵育1 h后,使用增强型化学发光底物系统检测蛋白印迹。

1.3 统计学方法 所有实验独立重复至少3次,采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用LSD-t检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠踝关节肿胀指数及步态评分比较 见表2。注射单钠尿酸盐后,模型组大鼠关节肿胀明显,踝关节肿胀指数及步态指数升高,部分出现三足步态,表明模型构建成功。干预后,秋水仙碱组、清热养阴除湿高剂量组、清热养阴除湿低剂量组大鼠踝关节肿胀指数、步态指数均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠踝关节肿胀指数、步态评分比较

2.2 各组大鼠关节组织病理学比较 见图1。空白组大鼠踝关节滑膜组织结构正常,滑膜细胞排列紧密,未见炎症细胞浸润。模型组大鼠踝关节滑膜组织显著增厚,细胞密度增加,出现炎症细胞浸润,主要表现为中性粒细胞、淋巴细胞聚集,滑膜表面可观察到尿酸晶体沉积,即痛风石形成。秋水仙碱组、清热养阴除湿低剂量组大鼠踝关节滑膜组织病理学改变相对减轻,滑膜组织厚度略有降低,部分炎症细胞浸润减少,但仍存在滑膜表面尿酸晶体沉积。清热养阴除湿高剂量组大鼠踝关节滑膜组织病理学改变明显减轻,滑膜组织厚度逐渐恢复正常,炎症细胞浸润减少,滑膜表面的尿酸晶体沉积减少。

A:空白组;B:模型组;C:秋水仙碱组;D:清热养阴除湿低剂量组;E:清热养阴除湿高剂量组

2.3 各组大鼠外周血炎症因子比较 见表3。模型组大鼠外周血IL-1β、IL-18、IL-33、TNF-α均高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,秋水仙碱组、清热养阴除湿高剂量组、清热养阴除湿低剂量组大鼠外周血IL-1β,IL-18、IL-33、TNF-α均低于模型组,且清热养阴除湿高剂量组的抑制效应最高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠外周血炎症因子比较(pg/ml)

2.4 各组大鼠滑膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达比较 见表4(图2)。Western blotting检测结果显示,模型组大鼠滑膜组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达均高于空白组;秋水仙碱组、清热养阴除湿高剂量组、清热养阴除湿低剂量组大鼠滑膜组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠滑膜组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达比较

2.5 各组大鼠滑膜组织线粒体自噬相关基因蛋白表达比较 见表5(图3)。模型组大鼠滑膜组织中LC3B、p62、PHB2蛋白表达均高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,秋水仙碱组、清热养阴除湿高剂量组、清热养阴除湿低剂量组大鼠滑膜组织中LC3B、p62、PHB2蛋白表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

A:空白组;B:模型组;C:秋水仙碱组;D:清热养阴除湿低剂量组;E:清热养阴除湿高剂量组

表5 各组大鼠滑膜组织线粒体自噬相关蛋白表达比较

3 讨 论

中药抗炎治疗痛风的理念源自整体观念、辨证施治原则。中医认为,痛风是由于体内湿热郁闭,气血运行不畅,导致炎症反应,尿酸晶体沉积在关节和组织中。因此,清热、养阴、除湿法,平衡体内阴阳气血,消除痛风发作原因,达到治疗疾病的目的。清热养阴除湿丸中金银花、连翘、半枝莲等具有清热解毒、祛湿利尿作用,可改善患者体内湿热病理状态;土茯苓则有利尿作用,促进尿酸排泄,降低体内尿酸积聚。前期研究显示,清热养阴除湿丸通过调节免疫细胞活性、免疫因子产生,增强机体免疫功能,减轻痛风引起的炎症反应[10]。

病理学检测发现,模型组大鼠踝关节滑膜组织显著增厚,细胞密度增加,出现炎症细胞浸润,滑膜表面可以观察到尿酸晶体沉积,而清热养阴除湿高剂量组大鼠踝关节滑膜组织病理学改变较轻,滑膜组织厚度逐渐恢复正常,炎症细胞浸润明显减少,滑膜表面尿酸晶体沉积减少,说明清热养阴除湿丸能有效逆转痛风大鼠滑膜组织病理变化。清热养阴除湿丸中的白花蛇舌草、虎杖、白鲜皮组分具有抗炎作用,能够抑制炎症细胞激活和炎症因子释放,减少炎症细胞在滑膜组织中的浸润[11-12];土茯苓、防己、牡丹皮等对尿酸晶体的形成和沉积具有积极影响,通过降低体内尿酸水平,减少尿酸晶体形成,改善尿酸晶体引起的炎症反应[13-14];生地黄、当归、桂枝有助于促进滑膜组织修复和再生,改善滑膜组织的细胞密度和结构,使其逐渐恢复正常[15-16]。ELISA检测显示,经清热养阴除湿丸干预后,大鼠外周血相关炎症因子水平下降。有研究发现,白花蛇舌草通过抑制核因子-κB(NF-κB)活性降低炎症因子表达。NF-κB是重要的转录因子,参与炎症因子基因转录调控[17]。清热养阴除湿丸的部分成分可调节NF-κB活性,抑制炎症因子表达。虎杖能够调节巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞活性,抑制其产生炎症因子[18]。

NLRP3炎症小体是痛风炎症反应的关键调节因子,当体内尿酸结晶沉积后,会引起炎症细胞激活,导致NLRP3炎症小体组装和激活。激活的NLRP3炎症小体会引发促炎细胞因子IL-1β、IL-18的产生,加剧痛风炎症反应[19]。线粒体自噬是细胞内线粒体选择性降解过程,具有清除受损线粒体和维持细胞能量代谢的作用。在痛风发病过程中,尿酸结晶的沉积会导致氧化应激加重,线粒体功能障碍[20]。线粒体自噬的活化可以清除受损线粒体,减少氧化应激和炎症因子产生。有研究表明,线粒体自噬功能障碍与痛风的发生发展相关[21]。通过促进线粒体自噬活化,减少尿酸结晶引起的炎症反应,缓解痛风临床症状[22-24]。本研究通过RT-qPCR、Western blotting检测发现,与模型组相比,清热养阴除湿高剂量组大鼠滑膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、LC3B、p62及PHB2的蛋白相对表达水平降低,说明清热养阴除湿丸能促进线粒体自噬,抑制NLRP3炎症小体激活。

综上所述,清热养阴除湿丸通过抑制NLRP3炎症小体形成及线粒体相关自噬的发生减轻痛风大鼠滑膜组织炎症,改善关节功能。