益心附葶饮对慢性心力衰竭心肾阳虚证大鼠HIF-1/VEGF信号通路的影响

陈铭钦,雷瑗琳,师瑞瑞,全依晨,周纳纳,陈晋玉,韩 茹

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳712046;2.西安市中医医院心血管内科,陕西 西安 710021)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是由于各种心脏疾病引起的心脏组织结构及功能异常,致使机体心室充盈功能低下或心室泵血不足,不能满足机体代谢需要,器官、组织血液灌注不足,出现肺循环和(或)体循环瘀血。CHF是各器质性心脏病发展到终末期的临床综合征,是心血管疾病患者死亡的主要原因,且其具有发病率高、再入院率高、病死率高的特点[1]。CHF 住院率占同期心血管病的 20%,病死率占40%,随着老龄化进程加快,CHF 发病率也呈逐年上升趋势,已成为威胁人类生命健康的最重要心血管病[1-2]。现代医学治疗慢性心力衰竭存在长期用药的耐药性问题、不良反应等,影响心脏不良事件及预后获益。中医学能够分时机、分阶段对患者复杂多变的证候制定相应的治疗方案,并具有突出优势。益心附葶饮是雷瑗琳主任医师根据多年临床经验制定的治疗CHF终末期验方。前期临床与实验观察表明,益心附葶饮对慢性心力衰竭终末期具有良好的临床疗效,机制可能与调整心肌细胞能量代谢有关,具有减少炎症因子释放,抑制心室重构,延缓心力衰竭发展的作用。近年研究发现,缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1α)能够促进 AS 斑块内炎症反应浸润和平滑肌细胞增殖、迁移,低氧下集聚的 HIF-1 能够激活血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体,促进调节血管新生。诸多学者通过临床观察发现,慢性心力衰竭晚期主要为心肾阳虚证、水饮上泛证,在选方用药上益气温阳化瘀利水法应用最为广泛,如苓桂术甘汤、真武汤、桂枝茯苓丸等能有效改善心力衰竭心肾阳虚证患者的心功能[3-5]。多项中医药研究表明,益气活血利水中药通过影响不同信号通路延缓其发生发展[6-7]。本研究通过观察益心附葶饮对实验小鼠心肌组织HIF-1α蛋白表达和HIF-1/VEGF信号通路抑制作用,探讨其抑制炎症反应、减缓心肌重构机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:清洁级雄性SD大鼠60只,平均体重(200±20)g,均购自中国人民解放军空军军医大学实验动物中心;许可证[SCXK(陕)20119-001]。饲以实验动物专用饲料(购自西安天工生物医药研究所),自由进食、饮水,平均温度(22±2)℃,平均湿度(60±5)%,光照为12 h明-暗循环,光照时段7:00～19:00,实验期间60只大鼠均未死亡。

1.1.2 实验试剂:羟基脲(批号C13337589,上海麦克林生化科技股份有限公司),PBS 1X(批号GA22090372609,武汉赛维尔生物科技有限公司),N端前脑钠肽(NT-proBNP,批号22090635N,上海科兴商贸有限公司) ,超敏C反应蛋白(批号22090641N,上海科兴商贸有限公司),内皮素1(批号22090645N,上海科兴商贸有限公司),白介素6(批号22090642N,上海科兴商贸有限公司),HIF-1α mRNA引物(上游批号A058407、下游批号A058408,武汉赛维尔生物科技有限公司),HIF-1α抗体(批号bs-0737R,北京博奥森生物技术有限公司),蛋白定量试剂盒(批号BA1207,南京建成生物工程公司),PVDF膜(批号0000167004,德国Merck Millipore公司)。

1.1.3 实验仪器:低温离心机(型号H2050R,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),包埋机(型号Histo Star,武汉俊杰电子有限公司),病理切片机(型号HM 340E,上海徕卡仪器有限公司),组织摊片机(型号TKY-TKA,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司),染色机(型号ST5010),高速组织研磨仪(型号OSE-Y30,武汉赛维尔生物科技有限公司),涡旋仪(型号QL-901,海门市其林贝尔仪器制造有限公司),低速离心机(型号TD4,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),化学发光成像分析仪(型号Mini Chemi 500,北京赛智创业科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 益心附葶饮:黑附片(先煎)、葶苈子、太子参、茯苓、丹参各30 g,白术、枳壳各15 g,川芎、桂枝各12 g,地黄24 g,砂仁9 g,以上药物由西安市中医医院制剂科提供颗粒剂。

1.2.2 建模、分组及给药:将60只雄性SD大鼠随机分为五组,每组12只,为防止动物死亡导致样本量不足,每组多备2只,共计70只。术前禁食8 h,将大鼠放置麻醉箱中,调整麻醉系统,异氟烷占异氟烷、氧气混合气体浓度4%～5%,大鼠持续吸氧3 min,麻醉后左前胸备皮后碘伏消毒、开胸,暴露心脏,在冠状动脉起始2～3 mm处结扎左冠状动脉前降支,关胸。术后1 d灌胃给予羟基脲300 mg/kg,1 次/d,连续14 d,建立心力衰竭心肾阳虚证模型。假手术组:只穿线,不结扎,灌胃给予0.9%氯化钠溶液2.5 ml/kg,2次/d,4周。模型组:制备心力衰竭模型,成模后灌胃给予0.9%氯化钠溶液2.5 ml/kg,2次/d,4周。中药低剂量组:制备心力衰竭模型,成模后给予生药0.25 g/ml,4周,2次/d。中药高剂量组:制备心力衰竭模型,成模后给予生药1 g/ml,4周,2次/d。缬沙坦组:制备心力衰竭模型,成模后灌胃给予缬沙坦1.14 mg/kg,2次/d,4周。

1.2.3 HE染色观察心肌病理组织学变化:石蜡切片依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min,自来水洗。苏木素染色:切片入苏木素染液染3～5 min,自来水洗,分化液分化,自来水洗,返蓝液返蓝,流水冲洗。伊红染色:切片依次入85%、95%梯度乙醇脱水各5 min,入伊红染液中染色5 min。脱水封片:切片依次放入无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、无水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明,中性树胶封片。显微镜镜检并图像采集分析。

1.2.4 qPCR检测心肌组织HIF-1 mRNA表达:组织中加入Trizol试剂提取mRNA,加入60 μl氯仿,强力振摇15 s,静置3 min,4 ℃、12000 r/min离心10 min,吸取水相即组织RNA提取物;加入100 μl异丙醇于水相静置10 min,4 ℃、12000 r/min离心10 min,沉淀RNA,弃上清;加入200 μl用DEPC水配75%乙醇洗RNA,4 ℃、7500 r/min离心10 min,弃上清,干燥RNA5～10 min;加入20 μl DEPC水溶解RNA,通过RNA定量仪对其进行定量,-80 ℃冻存。使用Evo M-MLV反转录试剂盒进行反转录(Reverse transcription,RT)反应,将提取的mRNA合成为cDNA;反应条件为37 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃。使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR),采用两步法对cDNA进行扩增,并对其进行荧光实定量,反应条件为95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40个循环。引物终浓度为0.4 μmol/L,GAPDH为内参,使用2-△△Ct方法计算相对表达量,并对产物的解链曲线进行分析,确保反应特异性,HIF-1上游引物5’-GGCGAAGCAAAGAGTCTGAAGT-3’、下游引物5’-TAGCACCATAACAAAGCCATCC-3’。

1.2.5 Western blotting检测心肌组织HIF-1蛋白表达:将组织用含有1%蛋白酶抑制剂的4 ℃预冷RIPA裂解缓冲液裂解,细胞裂解物在12000 r/min、4 ℃下离心10 min,收集上清液,保存待用。BCA法测定蛋白质浓度,10%的SDS-PAGE分离出等量蛋白质20 μg转移到PVDF膜上;于室温下用5%牛奶在TBST中封闭膜2 h,并于4 ℃与HIF-1一抗孵育过夜,再将膜与二抗于37 ℃孵育2 h;用ECL试剂盒对印迹进行可视化。

1.3 统计学方法 应用Graph Pad Prim 6.0统计学软件对数据进行分析。计量数据以平均值±标准差表示,组间均数的综合比较采用方差分析,组间两两比较采用Tukey检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织形态学比较 见图1。HE染色后观察大鼠心肌组织形态学变化,蓝色箭头所示为纤维组织。与假手术组比较,模型组大鼠各心肌细胞间距明显增宽,心肌纤维排列紊乱,有大量胶原纤维蛋白沉积,心脏纤维组织表达面积升高;与模型组比较,中药组各心肌细胞间隙缩窄,排列较整齐致密,大鼠心肌组织中仅见少量胶原纤维蛋白沉积。

图1 各组大鼠心肌组织形态学比较(HE染色,×40)

2.2 各组大鼠射血分数比较 见表1(图2)。由超声心动图检测可知,模型组射血分数低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05),可见造模成功。中药低剂量组、中药高剂量组、缬沙坦组大鼠射血分数均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠心功能射血分数比较(%)

图2 各组大鼠超声心动图比较

2.3 各组大鼠心肌组织HIF-1α mRNA表达及蛋白水平比较 见表2(图3)。模型组大鼠心肌组织HIF-1 mRNA及蛋白表达低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05),可见造模成功。中药低剂量组、中药高剂量组、缬沙坦组HIF-1α mRNA及蛋白表达均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠心肌组织HIF-1α mRNA及蛋白表达比较

图3 各组大鼠HIF-1α蛋白电泳图

2.4 各组大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6比较 见表3。模型组大鼠NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05),可见造模成功。中药低剂量组、中药高剂量组、缬沙坦组大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6水平比较

3 讨 论

各种条件导致慢性缺血缺氧是心血管疾病发生的前提,对冠状动脉疾病、心肌梗死、心力衰竭等的发生发展具有深远意义[8]。缺氧状态下,细胞的存活需要激活许多分子信号通路,以达到刺激血管生成、促红细胞生成以及有利于糖酵解的代谢重组模式,这种生物反应称为缺氧适应性反应[9]。心脏在遭受缺血损害、神经-内分泌系统调节紊乱、炎症细胞因子等慢性刺激后机体产生适应性反应,特征性的表现为心肌纤维化、心肌肥大和心肌细胞坏死凋亡,导致心肌重量、心室容量增加及心脏功能变化,即心室重构, 而心室重构是目前公认的诱导心力衰竭发生的紧要机制,也是心功能不全的独立危险因子,所以如何及时有效的预防和逆转心室重构过程是改善慢性心力衰竭转归的关键所在,探索心室重构发展进程中的相关信号通路及各通路抑制剂在心室重构的机制研究和临床应用等也显得尤为紧要。HIF-1是由α亚基和β亚基构成的异源二聚体,α亚基编码基因定位于第14 号染色体,为 HIF-1的活性亚基,受氧浓度变化的精确调节,是缺氧信号主要的、也是最普遍表达的调节因子。HIF-1α主要集中在心肌细胞上,HIF-1α不仅具有调节增加葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的转录以改善葡萄糖利用率功能,还能通过抑制线粒体呼吸以减少氧的使用,建立糖酵解和氧化代谢间的平衡关系,在不增加活性氧水平的状态下,达到腺苷三磷酸(ATP)的最高产量[10],且其在ECM重构和缺血预适应以及动脉粥样硬化进程中的作用已被证实。在一项小鼠心肌梗死的实验研究也证实HIF-1治疗心肌梗死,可缩小心肌梗死面积,改善左室重构[11]。Li等[12]首次提出 HIF-1α对心脏的损害作用,当心脏供血明显受限,敲除 VHL 基因会导致 HIF-1α缺氧反应通路的慢性激活,进而出现一系列的组织学改变,包含心肌细胞丧失和心肌纤维化等,最终导致心力衰竭加重。目前,学者普遍认为,HIF 激活在轻度缺氧时对心肌具有保护作用,但在慢性、重度缺氧状态等终末心力衰竭中对心肌有损害作用。Hoscher等[13]也发现在心肌病晚期心力衰竭患者中,HIF-1α的表达增加并处于持续激活状态。血管内皮细胞缺氧,又是加速动脉粥样硬化(AS)进程的重要影响因素。另一项研究显示,HIF-1α能够促进 AS 斑块内炎症反应浸润和平滑肌细胞增殖、迁移,低氧下积聚的HIF-1能够激活血管内皮生长因子(VEGF)和 VEGF 受体,促进调节血管新生。白杨等[14]通过建立新生大鼠原代心肌细胞培养模型,证明抑制 HIF-1α表达可能是辛伐他汀心肌保护作用的机制之一,这种保护机制可能与辛伐他汀减少缺血/再灌注损伤后的心肌细胞凋亡有关。以上研究显示HIF-1α的双向表达特征,即轻度缺氧时对心肌具有保护作用,但同时发现在慢性、重度缺氧状态等终末心力衰竭中对心肌有损害作用。

“心力衰竭”属于中医心力衰竭病,曾按照“喘证”“胸痹”“水肿”“肺胀”等辨治。《素问·痿论》记载:“心主身之血脉”,《素问·五脏生成篇》亦云:“诸血者, 皆属于心。”二者皆提示血脉的正常运行是心的功能,若心之气、阳虚衰,则血脉鼓动无力,血行不畅,进而留而为瘀。《素问·逆调论篇》:“若心气虚衰,可见喘息持续不已。”《素问·脏气法时论》说:“心病者,日中慧,夜半甚,平旦静”[15]。可见血脉正常运行有赖于心气与心阳的推动。国医大师邓铁涛[16]提出:心力衰竭就是因为心阳气虚衰,功能不全,血脉运行不畅,以致脏腑经脉失养,功能失调,治疗主张阴阳分治温补为上,对心力衰竭终末期辨治意义重大。雷主任总结多年治疗慢性心力衰竭经验,提出心气、心阳是心主血脉功能正常发挥的动力之源[17-18]。“血不利则为水”,瘀血留滞可化水为饮,水饮为有形实邪,易阻无形之气的运行,因“气为血之帅”,气行则血行,气滞则血瘀,水饮进一步加重血瘀,水饮与血瘀互为因果,互为影响。心力衰竭的病机虚实夹杂,表现在虚、瘀、水三端,三者又互为因果,其中心气虚、阳虚是内因,是病理基础;贯穿于心力衰竭发生与发展始终,影响着CHF的预后,病机关键点为心气心阳虚衰;痰浊、水饮和血瘀是主要病理产物[19]。故阳衰阴竭,水瘀互结是终末期心力衰竭的主要证候,助阳利水化饮通络是中医治疗基础。“益心附葶饮” 在原真武汤基础上创制,附子、葶苈子为君药,辅助利水化瘀中药,有助阳益阴、利水通络的功效,临床应用多年,能快速缓解临床症状,大大减少再次住院频次,具有良好的社会和经济效益。附子中的乌头碱会抑制心肌衰弱,起到保护心肌的作用[20]。葶苈子及其有效成分不仅能增加心肌细胞收缩能力,增加冠脉血流量,还具有显著抗脏器纤维化作用[21]。前期研究显示,益心附葶饮通过下调Collagen1、Collagen3蛋白表达和抑制NF-κB P65信号通路介导的炎症反应,抑制压力性心力衰竭大鼠心肌纤维化[22]。同时可抑制压力性心力衰竭大鼠心肌纤维化和心室重构,其作用机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活有关。

本实验研究证实,益心附葶饮特别在高剂量时,能有效提高心力衰竭小鼠射血分数,改善血流动力学, 同时抑制炎症因子,降低心肌纤维组织表达面积,降低心肌组织中HIF蛋白表达含量,抑制其异常过量沉积,发挥治疗心肌纤维化作用,对CHF终末期精准治疗有积极的指导意义。

综上,益心附葶饮可能是通过下调HIF-1α蛋白表达和抑制HIF-1/VEGF信号通路介导的抑制炎症反应,降低心力衰竭大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6表达从而减缓心力衰竭大鼠心室重构进程。