当归芍药散对血管性痴呆大鼠炎症因子及神经细胞凋亡的影响

姜 林,李 彬,臧运华,于 淼,王 群,周喜燕

(1.山东中医药大学,山东 济南 250355;2.青岛大学附属海慈医院,山东 青岛 266033)

血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)是一种神经认知障碍,是由于流向大脑的血流减少或缺乏而导致记忆、认知功能恶化,是年龄相关性认知障碍的第二大常见病因,占所有痴呆病例20%,仅次于阿尔茨海默病[1]。据世界卫生组织统计,每年新发痴呆患者35万以上,预计6年后将增加1倍[2]。血管性痴呆目前发病机制尚不明确且没有特效治疗方法,因此探索VaD发病机制对防治VaD具有重要意义。

当归芍药散出自张仲景所著《金匮要略》,由当归、白芍、川芎、白术、泽泻、茯苓组成,具有养血和血、活血化瘀功效,原文为治疗妊娠、产后腹痛。20世纪80年代日本学者水岛宣昭首次应用当归芍药散治疗痴呆,发现能明显减轻患者摄食、运动、智能障碍等[3]。现代研究指出,当归芍药散具有抗炎、抗氧化活性,能抑制肾上腺素能神经系统功能,改善中枢胆碱能神经系统功能障碍,减少海马细胞凋亡,缓解认知功能障碍[4]。因此,本研究以血管性痴呆大鼠为研究对象,基于炎症反应、神经细胞凋亡探讨当归芍药散对血管性痴呆的治疗作用,为疾病恢复提供新方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:纯种SPF级SD雄性大鼠30只,平均体重(200±20)g,由青岛市实验动物中心提供。在安静环境下分笼饲养,平均室温(23±1)℃,相对湿度60%,光线自动控制,明(7:00～19:00)、暗(19:00～7:00)交替,统一用颗粒型普通大鼠饲料喂养,自由饮用凉开水。自由摄食条件下适应性喂养1周。

1.1.2 实验药物:当归芍药散由当归、白芍、川芎、茯苓、泽泻、白术组成,所有药品均购自青岛市中医院中药房,药品均为道地药材。尼莫地平片(规格20 mg/片,批号H20003010)。

1.1.3 实验试剂:二甲苯、无水乙醇、碳酸锂、冰醋酸、30%H2O2(批号10023418、10009218、20022818、10000218、10011218,国药集团化学试剂有限公司);苏木素(批号G1004,Servicebio公司);Bax兔抗(1∶1000,批号PAB46088);Bcl-2兔抗(1∶1000,批号A00040-1,博士德公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6) ELISA试剂盒(批号QYH-12018);蛋白质Marker(批号P12103,Helix公司);PVDF转移膜、化学发光试剂(批号IPVH00010、WBKLS0500)。

1.1.4 实验仪器:正置显微镜、石蜡切片机(型号DM1000、RM2235,徕卡纤维系统有限公司);移液器(型号P100、P200,吉尔森P型移液器公司);恒温烘箱(型号DHG-9023A,上海一恒科学仪器有限公司);摊片烤片机、自动组织脱水机(型号TKD-TK、TKD-TSF,湖北康强医疗器械有限公司);生物组织包埋机-冷冻机(型号TB-718L,泰维科技公司);电泳仪(型号mini protean 3 cell);水迷宫(型号zs-Morris);水浴锅(型号HI1210);全自动化学发光仪(型号Tanon-5200);UPT优普特实验室超纯水器(型号ULUPURE)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及造模:大鼠适应性喂养1周后采用随机数字表法分为假手术组、模型组、当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组,各组6只。采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立血管性痴呆模型大鼠[5]。大鼠造模前禁食12 h,用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,仰卧固定于手术板上备皮消毒,分离双侧颈总动脉结扎,缝合切口。假手术组大鼠不结扎颈总动脉,只做皮肤切口和组织分离处理后缝合皮肤。手术后所有大鼠均应用青霉素10万单位肌注3 d预防感染。

1.2.2 给药方法:当归9 g,白芍48 g,川芎、泽泻各24 g,茯苓、白术各12 g,超纯水浸泡1 h后,煮沸,收集药液,再用6倍体积超纯水煮沸,收集药液,混合2次药液,60 ℃浓缩,分装置于-20 ℃冰箱保存,使用前加热稀释至所需浓度。各治疗组于造模完成1周后开始灌胃给药,当归芍药散低剂量组灌胃当归芍药汤1.8 g/kg;当归芍药散高剂量组灌胃当归芍药汤7.2 g/kg;尼莫地平组灌胃尼莫地平片20 mg/kg;假手术组、模型组灌胃等体积蒸馏水。各组大鼠均1次/d给药,持续4周。

1.2.3 Morris水迷宫测评实验:大鼠灌胃第4周,各组大鼠随机选取3只进行Morris水迷宫实验。定位航行实验测量大鼠学习能力,将水池分为4个象限,将各组大鼠按象限顺序依次面向池壁放入水中,记录90 s内成功爬上平台所需要时间,设定大鼠找到平台并滞留5 s及以上为成功,即逃避潜伏期。当大鼠超过90 s仍未找到平台时,则引导其至平台位置,并使其在平台上停留20 s后放回笼中,此类大鼠逃避潜伏期记90 s。每只大鼠每天训练4次,早晚各2次,每次不同象限测定时间间隔为1 h,连续4 d。第5天进行测试,取4个象限逃避潜伏期时间的均值作为学习成绩检测指标。定位航行测试完成后第2天,撤除实验平台,测试大鼠90 s进入穿越平台的次数。空间探索实验测量大鼠记忆能力。

1.2.4 标本采集及检测:术后30 d,提取Morris水迷宫后3只大鼠,1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉,腹主动脉取血,3000 r/min离心10 min,取上层血清,于-20 ℃中保存备用。开颅,取视交叉后4 mm与小脑前之间的部分即海马脑组织,用4%多聚甲醛固定备用。

1.2.5 脑组织病理:取出海马组织,石蜡包埋,做冠状切片,片厚3 μm,置于Eppendorf管中,-80 ℃保存。按照试剂盒使用说明进行HE染色。光镜下采用 Leica Application Suite图像采集样本相关位置,观察海马各区组织细胞学改变,评价神经元损伤程度及范围。

1.2.6 Western blotting检测海马组织Bcl-2、Bax蛋白表达:取出海马组织,提取总蛋白,BCA法进行蛋白浓度定量,对各组大鼠海马组织上述蛋白水平进行检测,以GAPDH为内参,进行蛋白条带灰度值数据分析。

1.2.7 免疫组化法检测海马组织Bc1-2、Bax蛋白表达:取出脑组织,切片用SP法染色,严格按照试剂盒说明进行。目标蛋白为棕黄色或棕褐色颗粒,光镜下每张片子随机选取3个视野,采用Image J软件进行平均光密度分析反映免疫组化的蛋白表达强度。

1.2.8 ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β含量:取出血清,按照ELISA试剂盒说明书操作,在多功能酶标仪450 nm波长处读取数值并进行分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫测评比较 见表1。模型组较假手术组大鼠逃避潜伏期时间延长;当归芍药散高剂量组、尼莫地平组较模型组逃避潜伏期缩短,差异有统计学意义(P<0.01)。当归芍药散低剂量组与模型组逃避潜伏期比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠穿越平台次数少于假手术组,当归芍药散低剂量、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组穿越平台次数多于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠Morris水迷宫测评实验比较

2.2 各组大鼠脑组织病理形态比较 见图1。假手术组大鼠海马神经细胞形态完整,排列紧密;模型组大鼠海马神经元呈现结构疏散、排列紊乱、胞核固缩、边界不清等病理学变化;当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组大鼠海马神经元改变均减轻,且当归芍药散高剂量组细胞层变厚,结构清晰,细胞核固缩减轻最明显。

图1 各组大鼠海马神经元形态比较(HE染色,×200)

2.3 各组大鼠海马组织Bcl-2、Bax蛋白表达比较 见表2(图2)。模型组较假手术组海马组织Bcl-2蛋白表达下降,当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组海马组织Bcl-2蛋白表达高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组较假手术组Bax蛋白表达增多,当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组Bax蛋白表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

A:假手术组;B:模型组;C:当归芍药散低剂量组;D:当归芍药散高剂量组;E:尼莫地平组

表2 各组大鼠海马组织Bc1-2、Bax蛋白表达比较

2.4 各组大鼠免疫组化海马组织Bc1-2、Bax表达比较 见表3(图3)。模型组海马组织Bcl-2平均光密度低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01)。当归芍药散高剂量组海马组织Bcl-2平均光密度高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。当归芍药散低剂量组、尼莫地平组海马组织Bcl-2平均光密度与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。假手术组Bax平均光密度值高于模型组,当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组Bax平均光密度值低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组大鼠海马组织Bc1-2、Bax光密度值比较(au)

2.5 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较 见表4。模型组血清TNF-α含量高于假手术组,当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组TNF-α含量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组血清IL-1β高于假手术组,当归芍药散低剂量组、当归芍药散高剂量组、尼莫地平组IL-1β含量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较(pg/ml)

3 讨 论

血管性痴呆在中医学归为“痴呆”“呆病”范畴。《临证指南医案》中记载“中风初起,神呆遗尿,老人厥中显然。”《杂病源流犀烛·中风》中记载“中风后善忘”[3],可见古代就出现了血管性痴呆的病症,临床表现为记忆力减退、呆傻愚笨等。关于痴呆的病因病机,主要是脾气亏虚为本,痰瘀阻络为标,以虚和瘀为主要病理因素,导致髓海不足,脑神失养[6]。当归芍药散中,芍药养血调经,柔肝止痛,归肝、脾经,为君药;川芎行气止痛,归肝、胆、心包经,为臣药;泽泻渗利湿浊,归肾、膀胱经,与川芎二者共为臣药;当归补血活血,归肝、心、脾经,助川芎行气化瘀、助芍药养血柔肝;茯苓、白术健脾燥湿,与当归同为佐药;和酒服用,可助血行,酒为使药。气血兼顾,养血行滞,痰瘀同治,寓攻于补[7]。李世英等[8]发现,当归芍药散可调节脑海马神经肽CGRP、ET-1、SS含量,改善血管性痴呆小鼠学习记忆能力。Itoh等[9]研究发现,当归芍药散改善了中枢胆碱能神经系统功能障碍和东莨菪碱诱导的小鼠大脑Ach水平降低,是治疗痴呆的有用方剂。Huang等[10]研究发现,当归芍药散通过改善APP/PS1小鼠氧化应激和炎症,改善认知缺陷。Lu[11]研究发现,当归芍药散能够改善大鼠学习缺失,此作用与提高体内超氧化物歧化酶有关。郑素霞等[12]研究发现,当归芍药散通过调节大脑海马自由基代谢,改善血管性痴呆小鼠学习与记忆能力。

神经炎症是痴呆神经变性的一个重要过程,涉及淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经元损伤、缠结形成和死亡的恶性循环。有证据表明,Aβ诱导的神经炎症与高水平促炎细胞因子有关,包括TNF-α、IL-6、IL-1β[13]。当脑损伤发生后,炎症因子聚集,激活APP切割酶β分泌酶来促进Aβ产生,诱导促炎细胞因子增加,加重炎症损伤,促进神经细胞凋亡[14]。此外,炎症反应还可通过级联反应,破坏血脑屏障,加重认知功能损伤[15]。潘艳芳等[16]研究发现,当归芍药散可抑制小鼠海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达,缓解小鼠认知功能障碍。宋祯彦等[17]研究发现,当归芍药散组大鼠炎症因子IL-1β和IL-18 mRNA表达显著降低,可抑制神经炎症反应,保护神经。姚丽伟[18]研究发现,当归芍药散活性成分可调节小胶质细胞M1/M2表型稳态,减轻炎症反应,阻滞细胞自噬,抑制细胞凋亡。

神经细胞凋亡指在某些生理和病理因素共同作用下激活细胞膜信号传导系统,促使相关凋亡调控因子启动,造成神经细胞死亡。神经细胞对血管性痴呆凋亡途径主要包括线粒体、Caspase家族、死亡受体、内质网应激等介导。内在凋亡途径主要依靠Bcl-2家族蛋白对线粒体外膜通透性调节。线粒体介导的凋亡通路主要与Bcl-2、Bax有关,Bcl-2是抑制细胞凋亡的调控蛋白,Bax是促进细胞凋亡的调控蛋白。线粒体途径在细胞内触发,激活Bax在线粒体外膜中形成孔,释放细胞色素C,降解细胞蛋白。正常情况下,Bcl-2和Bax保持平衡[19]。

海马是机体学习及记忆的高级神经中枢,当海马神经元处于应激状态,凋亡途径被激活,诱导Bcl-2等凋亡蛋白,促使海马神经细胞死亡,机体学习及记忆功能受损,产生认知功能减退[20]。李泽等[21]研究发现,当归芍药散组大鼠可增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,其机制是通过Bcl-2信号通路,改善Aβ诱导的胆碱能神经元凋亡。杨苗等[22]研究发现,当归芍药散组大鼠神经元凋亡率显著降低,Bcl-2/Bax比值升高,促进线粒体自噬,改善线粒体功能,发挥神经保护作用,因此抑制神经细胞凋亡可以起到预防VaD作用。

本实验表明,模型组大鼠较假手术组大鼠病理学形态紊乱,Bax、TNF-α、IL-1β含量明显增加,Bcl-2含量明显减少,逃避潜伏期时间延长,穿越平台次数减少,说明在VaD发病时,机体炎症反应、神经细胞凋亡被激活。当归芍药散各剂量组、尼莫地平组较模型组病理学形态呈不同程度改善,Bax、TNF-α、IL-1β含量减少,Bcl-2含量增加,逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数明显增加,其中当归芍药散高剂量组改善最显著,说明高剂量当归芍药散可明显降低血管性痴呆大鼠炎症因子神经细胞凋亡。