脂肪干细胞来源外泌体的骨组织工程研究进展

刘俊豪,熊永斌,何永好综述,李春亮审校

0 引 言

脂肪组织中含有多种类型的细胞,其中包括前脂肪细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞和常驻单核细胞、血管平滑肌细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等[1]。2001年,Zuk等[2]首次从脂肪组织中分离出脂肪干细胞,并发现其通过诱导分化,具有成骨、成软骨、成脂肪和神经表型的能力。脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)来源丰富、取材方便、免疫原性低、增殖速度快、表型稳定、具有多向分化潜能,是骨组织工程中一种理想的种子细胞[3]。如今,ADSCs已成为成为干细胞领域中最受欢迎的干细胞群之一,并广泛应用于组织工程研究[4]。外泌体是一种由细胞分泌的直径为30～150 nm的微小囊泡,含有蛋白质、mRNA、miRNA、脂质及信号因子,能够传递多种生物学活性物质,促进细胞间交流,参与体内生物学活动,对身体各系统具有再生修复作用[5]。近五年,骨组织工程研究对外泌体进行了大量研究,发现其在组织损伤修复中具有积极作用。外泌体不仅与干细胞具有相似生物学效能,还比干细胞更为安全稳定,具有强大的细胞因子调控能力,在组织再生和组织修复方面表现出广阔的应用潜力[6-7]。本文就脂肪干细胞来源外泌体在骨组织工程方面的研究进展作一综述。

1 ADSCs来源外泌体概述

1.1 ADSCs特征及优势干细胞是一种具有多向分化及自我复制能力的细胞,能够分化为多种子代细胞。自2001年Zuk等[2]首次分离出ADSCs后,研究发现相比其他间充质干细胞,ADSCs具有诸多优点,主要包括:①广泛存在于脂肪组织,来源充足;②通过吸脂术获取脂肪组织,即可从中提取ADSCs,取材方便,代价较小;③相比骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived stem, BMSC),ADSCs产量较高,获取率达1%～2%(骨髓间充质干细胞获取率仅为0.001%～0.002%),且使用胶原酶消化法或直接离心法等较为简单的方式即可进行分离[8];④稳定性好,安全性高,免疫排斥性低。基于上述优点,多项研究聚焦于ADSCs向多种细胞的分化能力,探究其对不同组织的修复能力。

随着对ADSCs研究的不断深入,大量研究表明ADSCs在体内、体外均具备多向分化潜能,如向骨细胞、血管内皮细胞、神经细胞等的分化[9]。陆诗等[10]研究发现,黄精多糖能够通过调节Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达,促进ADSCs成骨分化,治疗小鼠骨质疏松。Kayabolen等[11]联合脂肪组织和纤维蛋白混合制备水凝胶三维支架,并发现ADSCs在该支架中能够引起缺氧,加速血管内皮细胞表达,促进血管生成。

1.2 ADSCs外泌体种类及功能外泌体是由多泡体与细胞膜融合后,释放至外环境中的30～150 nm的生物囊泡,可携带细胞特定的蛋白质、脂质和遗传物质,并选择性地被细胞吸收。外泌体作为一种非侵入性的诊断生物标志物和治疗性的纳米载体,具有生物学意义和研究价值[12]。同样,ADSCs来源外泌体携带丰富的细胞活性物质,如蛋白质、mRNA及microRNA等,可通过介导细胞间信息沟通,促进受损组织修复、调节免疫、抵御炎症等[13]。研究表明,ADSCs来源外泌体可以:①通过促进创面修复细胞增殖迁移,促进血管再生,加速胶原合成,修复创面[14];②促进神经元细胞增殖迁移,抑制神经瓦氏变性,控制内啡肽酶活性,减缓神经退行性疾病的发生和发展[15];③诱导T细胞凋亡,诱导巨噬细胞极化,提高癌细胞对化疗药物的耐药性,抑制药物敏感性,干扰细胞发展周期,抑制肿瘤生长,同时还可同靶向蛋白共同作用,精准递送治疗药物[16];④促进血管生成,抑制心脏纤维化,保护心肌细胞[17];⑤促进巨噬细胞向M2极化,调节免疫细胞,抑制炎症因子,进行免疫调节[18];⑥减轻肾小管损伤,抑制炎症,抑制氧化应激,保护肾脏功能[19];⑦促进破骨细胞增值分化,抑制破骨细胞活性活性,维持骨环境稳态,调节骨与软骨组织损伤。

2 ADSCs来源外泌体促进骨再生的机制

ADSCs来源外泌体可通过抑制低氧缺血环境诱导的骨细胞凋亡,促进骨再生。研究发现,ADSCs来源外泌体可显著抑制低氧缺血环境下MLO-Y4细胞中骨细胞的凋亡率[20]。对ADSCs进行24h低水平激光照射,将该来源外泌体加入缺氧缺血环境下的MLO-Y4细胞,可使抗凋亡蛋白bcl-2表达水平上升,抑制促凋亡蛋白Bax表达[21]。ADSCs来源外泌体不仅可以通过降低RANKL以及RANKL/OPG表达,抑制破骨细胞生成[22];还可抑制骨细胞中IL-1b和IL-18的分泌,从机制上看,就是抑制了破骨细胞中NLRP3炎症小体的激活,进而减少骨吸收,恢复骨质流失[23]。

ADSCs来源外泌体可促进干细胞的增殖、迁移和成骨向分化,进而促进成骨。如ADSCs来源外泌体可调控骨钙素蛋白和骨桥蛋白表达升高,促进人牙髓干细胞增殖和成骨分化[24]。此外,该来源外泌体可显著增强hADSCs中RUNX2和ALP表达,诱导hADSCs成骨分化[25]。实验表明,ADSCs来源外泌体能够在1～14 d内被hADSCs有效内化,能让外泌体发挥最大效能的浓度在15 μg/mL[25]。ADSCs来源外泌体也可通过增强ALP、RUNX2的表达,促进BMSC的增殖、迁移和成骨分化[26]。Wnt/β-catenin通路参与细胞增殖、分化和凋亡,尤其在成骨细胞的分化中具有重要作用。ADSCs来源外泌体可通过调控β-catenin蛋白水平,促进ADSCs向成骨分化[27]。该研究还发现,加入DKK-1蛋白,抑制Wnt/β-catenin通路后,ADSCs成骨分化能力虽减弱,但仍较无外泌体处理的空白组强,说明脂肪干细胞来源外泌体并非通过单一通路促进骨修复,而是通过多个通路协同作用。

预调整外泌体的细胞因子表达,靶向成骨分化相关信号通路,是ADSCs来源外泌体促进骨再生的重要机制。经miR-130a-3p预处理的ADSCs来源外泌体可降低miR-130a-3p靶点SIRT7的蛋白及mRNA水平,显著提升成骨信号通路Wnt/β-catenin的表达,进而促进成骨[28]。类似地,上调ADSCs来源外泌体中miR-375的表达,应用于小鼠骨缺损模型,可发现RUNX2,ALP,COL1A1和骨钙素蛋白表达上调,BMSC的成骨分化能力得到促进[29]。另有研究建立蛋白多糖诱导的强直性脊柱炎模型,发现转染培养miR-21过表达的ADSCs来源外泌体可下调脊柱中白细胞介素(IL)-6表达水平,减少破骨细胞数量,增加骨矿物质含量和密度,有效改善强制性脊柱炎小鼠的骨质疏松症[30]。经miR-378修饰的ADSCs来源外泌体可负向调控融合抑制因子(Sufu),激活Sonic Hedgehog (Shh)信号通路,促进人脐静脉内皮细胞和人骨髓间充质干细胞血管生成和骨生成,对糖皮质激素诱导的股骨头坏死有治疗作用[31]。使用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)预处理的ADSCs来源外泌体中Wnt-3a表达水平显著提升,增加了外泌体对人原代成骨细胞 (HOBs) 的营养功能,进而促进HOBs的增殖与成骨分化[32]。使用长链非编码RNA-KCNQ1OT1 (lnc-KCNQ1OT1) 修饰ADSCs,并提取外泌体作用于TNF-α诱导过的HOBs,发现经lnc-KCNQ1OT1处理的ADSCs来源外泌体对经TNF-α诱导的HOBs的细胞毒性和细胞凋亡有明显抑制作用,其作用靶点为 miR-141-5p[33]。

3 ADSCs来源外泌体促进软骨修复的作用机制

ADSCs来源外泌体还可通过抑制抗炎因子表达,提升巨噬细胞迁移能力等方式,促进软骨修复。实验研究表明,ADSCs来源外泌体可靶向调控软骨细胞中的Wnt/β-catenin信号通路,促进自噬细胞迁移,进而起到软骨修复的作用[34]。注射ADSCs来源外泌体的关节内移植物与骨的愈合界面间隙更小,纤维软骨更多,在八周时有更多的纤维组织和成熟胶原蛋白,且具有明显巨噬细胞分化趋势,其中促炎性M1巨噬细胞明显较少,修复性M2巨噬细胞数量增多[35]。体外和体内研究均表明ADSCs来源外泌体可介导M1/M2极化,促使M2极化增强,明显改善小鼠肌腱的炎症状态,其组织学特征和生物力学强度也有所提高[36]。

Li等[37]不仅验证了ADSCs来源外泌体对巨噬细胞极化的调节作用,还发现该外泌体是通过上调miR-451a表达,通过靶向巨噬细胞迁移抑制因子(MIF),促进巨M1向M2的极化。Wu等[38]发现髌下脂肪垫间充质干细胞来源外泌体可通过上调miR-100-5p,抑制mTOR的表达,明显提高软骨细胞自噬水平,进而对软骨产生保护作用,并改善步态异常。另有研究发现,ADSCs来源外泌体可以降低有关细胞衰老的β-半乳糖苷酶活性及γH2AX foci的形成,还可减少IL- 6和前列腺素E2等炎症因子的表达,对关节炎症有相当的治疗潜力[39]。此外,lnc-Gm37494高表达可抑制 miR-130b-3p表达,促进过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARγ) 表达,从而促进小胶质细胞M1/M2极化,抑制炎症因子表达,促进脊髓损伤修复[40]。

4 ADSCs来源外泌体的治疗方法

根据纳入文献结果总结,ADSCs来源外泌体治疗方法主要分为两种,一种是注射法,第二种是使用组织工程支架负载ADSCs来源外泌体,作用于缺损部位。因注射法操作繁琐,且因外泌体易流失,治疗效果难以维持,因此近5年的研究多从组织工程学角度对ADSCs来源外泌体治疗方法进行创新,使用丝素/壳聚糖、水凝胶或金属有机框架等组织工程支架负载外泌体,对骨缺损部位进行治疗。该方法可将外泌体与支架进行良好结合,充分发挥外泌体的治疗效果,具有促进骨再生,治疗骨缺损的潜力,在骨组织修复领域有广阔应用前景。

将ADSCs来源外泌体与丝素/壳聚糖三维支架复合物结合,可促进ADSCs的成骨分化,丝素/壳聚糖三维支架材料的多孔结构使得细胞更易在材料空隙及表面黏附和增殖,且浓度为为5 μg/μL的外泌体矿化效果最强,对ADSCs的增殖作用也最强[41]。陈义庆等[42]制备含壳聚糖、纳米羟基磷灰石、胶原和β-甘油磷酸钠 (CS/nHAC/β-GP) 的水凝胶,负载ADSCs来源外泌体,并检测外泌体作用于该水凝胶的成骨能力。该研究发现,二维培养水凝胶不利于细胞生长,抑制细胞分化,三维培养的CS/nHAC/β-GP水凝胶更利于细胞黏附、增殖和分化,且外泌体负载的水凝胶成骨能力有显著提升,ALP活性和矿化作用更为明显。

Gandolfi等[43]使用聚乳酸、硅酸钙和硅酸二钙制备多孔支架 (PLA-10CaSi-10DCPD和PLA-5CaSi-5DCPD),用以负载ADSCs来源外泌体,并测定在该支架周围培养的ADSCs成骨分化能力。结果显示,支架在模拟体液内培养28d后,支架孔隙率下降,形成了一个适合骨形成的微环境,增加了所培养ADSCs的成骨分化能力。Li等[44]将ADSCs来源外泌体与聚乳酸-乙醇酸 (PLGA) 支架相结合,发现能够加速小鼠小腿骨缺陷恢复。外泌体固定于聚多巴胺包裹的PLGA支架,得以缓慢而稳定地释放,促进间充质干细胞的增殖、迁移,促进骨再生能力,在修复骨缺损方面具有良好潜力。

此外,Kang等[45]将焦点转向金属有机框架 (MOF) ,利用其装在ADSCs来源外泌体,用于骨缺损修复。该研究利用PLGA、Mg2和GA构建了一种具有独特纳米表层的无细胞支架 (PLGA/Exo-Mg-GA MOF) ,发现其负载的外泌体可以持续缓慢释放长达10天,被所培养细胞稳定吸收,血液供应充足,植骨环境稳定,促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化,人脐静脉内皮细胞的血管生成以及RAW264.7的抗炎作用。

5 ADSCs来源外泌体在骨组织工程的应用前景和挑战

外泌体相较于干细胞更便于存储和转移,所面临的免疫排斥风险更低,且具有较高生物安全性,在骨组织工程领域具有广阔应用前景,目前也有相当数量的外泌体研究取得了令人振奋的成果[46]。在促进骨再生方面,ADSCs来源外泌体可减少缺血和缺氧微环境的骨细胞凋亡,抑制破骨细胞生成[20-22],还可通过调控Wnt/β-catenin,RUNX2等成骨相关信号通路,进而促进间充质干细胞的增殖和成骨向分化[24,26-27]。此外,通过对ADSCs外泌体进行预处理,使得特定的细胞因子过表达,或者改变外泌体的诱导环境,增加其促进间充质干细胞成骨分化的能力[28-29,32,40]。骨关节炎作为一个非常复杂的多因素疾病,目前并无十分良好的治疗方法。ADSCs来源外泌体可以通过促进巨噬细胞极化、抑制抗炎因子表达等方式,促进软骨修复,同时在骨质疏松和肌腱-骨愈合等方面具有治疗效果[23,34-35]。尽管ADSCs外泌体对于促进骨再生的效果十分显著,但是其具体作用机制,以及究竟是外泌体中哪些被选分子发挥作用仍待研究。此外,有研究发现,ADSCs外泌体并非通过单一信号通路,而是通过通路网络促进干细胞成骨分化,这些通路是哪些,如何协同促进成骨分化,仍有待研究[27]。

骨组织工程的研究进展离不开对合适种子细胞和支架材料的筛选和优化,将ADSCs来源外泌体与组织工程支架材料相结合,是一种新的治疗手段,具有极大的应用前景。使用丝素-壳聚糖、三维培养水凝胶和金属有机框架等材料构建组织工程支架,并负载ADSCs来源外泌体,可以构建更为稳定的植骨环境,使外泌体在骨缺损部位持久稳定释放,更为有效地促进骨组织再生[42-43]。但是,组织工程支架对干细胞培养的毒性和不良反应仍待进一步研究,其与组织和细胞的相容性,以及在人体内的降解情况等问题仍尚未解决[41]。

值得注意的是,尽管ADSCs来源外泌体在组织工程的应用前景十分广阔,但关于外泌体的提取、鉴定及大规模量化生产仍是一个挑战,无法满足现有的临床需求[47]。现有的ADSCs来源外泌体的提取方法有超速离心法和ExoQuick试剂盒法,研究发现,在ExoQuick试剂盒法前加一步超速离心法,可提高外泌体的提取效率,且能够提取更高纯度、诱导效果更好的外泌体[48]。在ADSCs来源外泌体方面,目前有形貌鉴定、透射电子显微镜、免疫磁珠法和流式细胞学检测等鉴定方式[49-50]。此外,在ADSCs来源外泌体的应用中,其安全使用剂量以及最佳使用剂量仍待进一步探究。有研究表明,ADSCs外泌体浓度过高时,会降低巨噬细胞的存活率,不利于细胞的生长和增殖[51]。

6 结 语

ADSCs来源外泌体可通过促进骨细胞生成和破骨细胞凋亡,诱导低氧缺血环境下骨组织再生,还可以提高间充质干细胞的增殖及成骨向分化能力。通过对外泌体的细胞因子表达进行调控,可提升外泌体促进BMSC、ADSCs和人脐静脉内皮细胞等的成骨分化和生成血管能力。在软骨修复方面,ADSCs外泌体可通过调控自噬细胞迁移能力,抑制炎症因子表达,调控抗炎因子表达水平,进而促进软骨修复,达到保护软骨的治疗效果。其与骨组织工程材料的有效结合,可构建更适于骨组织生长、骨重建的环境,为未来骨组织工程研究提供广阔的研究方向,但是ADSCs外泌体在骨组织工程的研究仍面临诸多挑战,尤其是如何更为安全、有效且广泛的应用于临床,仍有待更深入的研究。