骨老龄化引起骨折修复的研究进展

江磊，倪宁，陈剑明

随着全球老龄化的进程，老年人骨质疏松症发病率及引发的骨折也逐渐增加[1]，因骨质疏松而导致的骨折（如股骨骨折）临床治疗效果差，大多是采用人工关节置换[2]，并且医疗费用较高[3]。骨质疏松症的患者还可以通过药物治疗（如合成代谢或者抗吸收），但是药物全身效应及不良反应严重影响了治疗效果[4]。骨折的愈合通过炎症、修复及重塑的阶段进行[5]。调节炎症可以对损伤后的愈合有较大的帮助，而骨质疏松症患者多出现隐匿性骨折，往往没有明显的感染而呈现低度慢性炎症过程[6]。因此骨质疏松症患者引起的骨折通过适当调节炎性反应，具有较好的治疗效果[7]。

骨老龄化是骨再生不平衡的另一种特征，表现为骨形成减少并出现骨吸收增加，从而使骨折后骨愈合受损。大量数据表明，骨折的愈合驱动在于骨骼干细胞（SSC），SSC具有自我更新、促进骨关节炎及骨折愈合等能力。近期研究报道结果发现衰老能影响干细胞功能[8]。然而，长期以来，人们只能够在培养基中培养和分离出一种被认为是SSC 的细胞群，这些细胞由多种类型的干细胞组成，并非最原始的SSC。后来，通过谱系追踪和克隆等研究方法，科学家发现了支持小鼠SSC 存在的证据[9]。这为研究开辟了新的途径，包括老龄化骨折后骨骼干细胞（SSC）激活的影响。

1 炎症/老龄化

炎症反应是骨骼损伤后启动骨折愈合的首要过程。损伤后急性炎症细胞如（中性粒细胞）会对骨折处血肿初步形成做出反应。急性炎症反应中的巨噬细胞分泌的细胞因子和炎症介质会继发引起SSC及祖细胞对骨折部位进行修复[10-11]。除损伤部位产生急性炎症外，炎症的消退对骨折的愈合也至关重要。由于衰老组织的特征是持续性低度慢性炎症状态[12]，因此衰老引起的慢性炎症可能对老年人骨折愈合的适当炎症介质启动有一定影响。最新研究表明，急性炎症反应的适当启动及短暂炎症消退对于刺激骨折愈合是至关重要的[13]。急性炎症期，典型的炎症介质M1 型巨噬细胞被激活，炎症消退包括巨噬细胞复极是激活炎症介质M2 型巨噬细胞的表现，并与组织再生密切相关[14]。在老龄化中骨折引起的慢性炎症会导致巨噬细胞从M1 型到M2 型复极失败，使骨细胞活性增加，而成骨细胞形成减少[15]，导致故愈合障碍。此外在老龄化中，通过肿瘤坏死因子（TNF）- 等介质持续存在的无对抗性炎症刺激，能促进破骨细胞生成和骨吸收[16]。

近期有研究显示，小鼠模型支持衰老相关引起慢性炎症损害骨骼再生的论证（封三彩图3），利用荧光激活细胞分类（FACS）分析在年轻小鼠和老年小鼠股骨颈部外周血炎症反应对比，发现老年小鼠组中损伤前基线水平在促进炎症、经典的激活单核细胞百分比支持慢性炎症状态有显著统计学意义[17]。针对损伤的反应，老年小鼠比年轻小鼠表现出更高比例的循环的、典型激活的单核细胞。相比之下，老年小鼠没有表现出随后非经典单核细胞的激活的增加。使用聚合酶链反应（PCR）对老年小鼠和年轻小鼠损伤后2 周的骨折骨痂组织进行基因表达分析，以评估衰老过程中骨折的不同转录反应。在年轻的骨折骨痂标本中，炎症基因表达下调，而在老年小鼠的标本中，则保持上调，且老年小鼠几种Toll样受体（TLR）上调[18]。MyD88 是一种衔接蛋白，它介导TLR 信号分泌炎性细胞因子和招募免疫细胞。而MyD88 活性在老龄小鼠和老年人骨折患者中均增强。通过小分子抑制剂在小鼠骨折部位的胶原海绵上抑制MyD88 二聚和活化，通过增加新骨形成和骨痂形成促进骨折愈合。这些数据表明，分子疗法对骨折部位炎症反应的调节可能具有促进老年人骨折愈合的转化潜力[19]。

免疫细胞和活化的干细胞之间的作用可对骨折部位的愈合具有极其重要的作用，而在衰老时这种相互之间的关系可能被中断。在组织中，细胞因子环境促进细胞衰老是慢性炎症的特征，称之为衰老相关分泌表型（SASP）[20]。最新研究发现小鼠的骨骼中存在SASP，这是导致常驻干细胞衰老和功能受损的因素之一[21]。TNF- 、白介素（IL）-1 和活化B 细胞p65（Rela）的核因子- 轻链增强子是目前所知道的导致这种效应的细胞因子。NF-KappaB 是一种炎症介质，它通过信号传导促进炎症细胞因子的分泌。该介质在衰老小鼠的细胞中显示激活状态，随后实验继续表明小鼠骨骼干和祖细胞中NF-KappaB活性的病理激活导致细胞衰老和成骨干细胞分化受损[22]。相反，通过全身抗炎或使用选择性小分子拮抗剂，通过药物抑制NF-KappaB，可部分逆转受损的成骨表型[23]。在骨折愈合过程中，干细胞也与巨噬细胞招募增加有关。

为了更好的利用干细胞调节炎症反应的能力，已经开发了几种基于细胞和小分子的策略。在存在炎症刺激的情况下首先对干细胞进行预处理（“启动/激活”）[24]。随后，激活的干细胞促进急性炎症反应的消退并开始愈合[25]。同样，小分子策略也可以促进从急性炎症反应到促进愈合的转变。

2 SSC

SSC 被认定为：能够自我更新；经历向骨、软骨和基质细胞群的多普系分化[10]；根据细胞表面标志物可前瞻性分离；排除脂肪等非骨骼化[25]。干细胞作为一种细胞治疗手段，在再生受损骨骼组织中具有很好的前景，但是由于干细胞分离困难的局限性，导致利用干细胞对骨组织再生的想法尚未实现。图1 显示骨折的SSC在老龄化慢性炎症对骨折的愈合的影响。在衰老的情况下M1 型巨噬细胞对SSC 的初始炎症反应和信号传导异常，包括NF-kappaB 信号传导增加。促炎环境还表现为促进炎症消解的细胞因子的生成减少，同时M1 型巨噬细胞对M2 型巨噬细胞的复极性受损。延长炎症信号导致SSC 的成骨分化受损，SSC 衰老加剧（抗衰老信号减少，如SIRT1）。同时，延长炎症信号传导（如TNF- ）会导致破骨细胞活化和骨吸收增加。

通过使用细胞表面标志物差异的干细胞群体经过FACS 纯化的方法，成功实现了小鼠骨骼干细胞（MSSC）和人类骨骼干细胞（HSSC）的区分，骨骼的骨、软骨和基质细胞谱系是由自我更新的多能干细胞（SSCs）生成的。尽管不依赖于精确的干细胞分离方法会导致细胞群的可变性和异质性，但通过FACS纯化，能够前瞻性地分离SSC，并从干细胞的角度研究老龄化对骨折愈合的影响。

在小鼠发生骨折过程中，衰老会导致mSSC 功能受损。对老年小鼠与年轻小鼠骨折部位SSCs 的分析表明，它们的自我更新能力和骨软骨生成分化能力均降低。此外，来自衰老小鼠SSC 的骨髓基质细胞对造血功能有负面影响。在老年小鼠中，观察到与年轻小鼠相似的循环炎症细胞现象，老龄化SSC 出现年轻小鼠类似功能缺陷，而衰老炎症细胞同样使年轻小鼠SSCs 产生功能性衰老[26]。这些数据表明，循环炎症反应中与年龄相关的变化可以影响SSC 功能。

通过全转录组测序显示，SSC存在不同的亚群，这些亚群基于富集的表达基因，这可能是对其他相关的启动。在调查老龄化动物SSC 转录多样性中发现多样性明显减少，且显著偏离成骨潜能，而前基质转录活性增加[27]。此外，老龄化的mSSC 在造血谱系中明显趋于破骨细胞发生，从而进一步提供衰老导致骨吸收的机制。在人类研究中，对年轻人和老年人的骨折中获取hSSCs 进行比较[28]，发现年轻人与老年人SSC 有较大差异，而老年人和年轻人骨折来源的SSC 的克隆原性/干细胞自我更新特性无明显差异，这与最近在小鼠身上进行的研究相反，该研究显示SCC 随着年龄增长减少[29]。一种假设是，老龄化SCC 的终末分化受损从而导致退出干细胞池，从而使得老年人干细胞减少。但是，相比年轻SSC，老年SSC 在成骨和成软骨分化能力方面表现出明显缺陷（封三彩图4）。此外，使用微阵列进行的整体基因表达分析表明，老年人骨折导致SSC 中的成骨基因下调。转录组学分析还显示，在老年SSC中，细胞衰老途径上调，抗衰老因子下调，如组蛋白脱乙酰酶Sirtui1。有趣的是，激活Sirtuin 信号的小分子可以部分恢复老年性hSSC 的成骨分化表型。因此，在骨折修复过程中，老龄化不仅与干细胞性成骨缺陷有关，而且还表明细胞抗衰老信号减弱。这些研究表明，分子疗法是失调的衰老细胞途径中治疗骨折疏松引起骨折愈合障碍的潜在靶点。

3 总结与展望

老龄化是引起骨折患者发病率增长的主要来源之一，其骨折愈合障碍风险也成比例增高，而炎症反应和SSC 在细胞及分子水平上对骨折愈合产生了巨大影响。这些大量的研究结果表明在老龄化及骨质疏松背景下通过干预骨折愈合的治疗策略上具有潜在的发展前景。

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