超声处理结合pH值调控对白果分离蛋白/乳清分离蛋白复合凝胶特性的影响

尤洁瑜，唐长波，张露妍，张 薇，王耀松,*

（1.南京林业大学轻工与食品学院，江苏 南京 210037；2.南京农业大学食品科学技术学院，肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 210095）

银杏果俗称白果，作为一种药食同源物质，其内含丰富的生物活性物质[1]，因此逐渐进入功能性健康食品的范畴[2]。近些年，随着银杏树的广泛种植，其果实的开发利用逐渐受到重视，特别是其果实的蛋白组分引起了人们广泛的关注[3]。在前期的研究中，有学者发现白果分离蛋白（ginkgo seed protein isolate，GSPI）具有一定的凝胶性和营养价值，然而其食品品质有待进一步提高[4]，以满足实际食品应用体系对其感官品质及营养品质的要求[5]。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）作为食品工业中常见的食品配料[6]，其主要组分为各类球蛋白，具有极高的营养价值以及极好的成胶性[7-8]，已广泛应用于各类食品体系[9]。然而在乳清蛋白生产过程中会增加温室气体的排放，且所需土地面积较大，成本相对较高[10]，将其引入到GSPI中可在弥补GSPI凝胶性能缺陷的同时降低食品生产成本。有研究表明，乳清蛋白无论与植物蛋白（如大豆蛋白[11-12]、菜籽蛋白[13]）还是动物蛋白[12,14]复合，其所形成复合物的凝胶性能均能得到显著提升。

简单地将两种蛋白混合虽然能够提高存在缺陷一方的蛋白性能，但复合蛋白的功能特性仍有进一步提高的空间。超声处理作为一种简单高效的物理加工手段被广泛应用于蛋白改性中[15]，超声改性蛋白主要是通过超声产生的空化效应、剪切和液体湍流等方式，影响蛋白质分子间的疏水相互作用、氢键、二硫键等作用[16]，从而改变蛋白的功能特性；在蛋白凝胶体系中，超声处理能够显著改善各类蛋白的凝胶特性[17]。此外，蛋白的凝胶性受pH值的影响较大[18]。

本研究将GSPI与WPI进行复合，采用不同超声功率处理并调控pH值，通过表征复合蛋白溶液的物化性质、蛋白分子行为及所形成热诱导凝胶的质构、持水性及微观结构，探究超声处理及pH值对复合凝胶成胶性的影响，以期提升凝胶的质地性能和持水性能，为实际食品工业生产提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白果 徐州淳康生物有限公司；WPI（蛋白相对含量90%） 美国Hilmar公司；正己烷 上海凌峰化学试剂有限公司；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SpectraMax i3x多功能酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；JY92-IIDN型超声波细胞粉碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS90粒径电位分析仪 英国Malvern公司；TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；VERTEX 80 V傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrum，FTIR）仪 德国Bruker公司；Prisma E环境扫描电子显微镜 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 GSPI的提取

参照Zhang Weiwei等[19]的方法提取GSPI。将去皮的白果仁置于40 ℃烘箱中干燥72 h，用粉碎机粉碎后过80 目筛。将白果粉与正己烷按1∶9（m/V）的比例混合，脱脂2 次。采用碱溶酸沉法，将得到的脱脂粉按1∶10（m/V）溶于去离子水中，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，在室温下搅拌30 min，然后在10 000×g、4 ℃的条件下离心15 min。用1 mol/L HCl溶液调节离心后的上清液至pH 4.4，在相同条件下离心15 min。将离心后的蛋白沉淀分散于5 倍质量的去离子水中，用1 mol/L NaOH溶液调至pH 7.0，冷冻干燥后备用。

1.3.2 GSPI/WPI溶胶的制备

将GSPI和WPI分别溶解在去离子水中，质量浓度均为120 g/L，室温下搅拌4 h，然后置于4 ℃下储存过夜，确保溶液均匀分散并完全溶解。将过夜储存的两种蛋白溶液按体积比1∶1混合（pH 6.7），并在200 r/min下搅拌2 h。将混合溶液分成3 份，用1 mol/L HCl溶液分别调至pH 4.0、5.0、6.0，继续搅拌1 h。将不同pH值的混合溶液分为4 份，共12 份，每份6 mL。将质量浓度为120 g/L的GSPI/WPI蛋白溶液转移到内径2.0 cm、高3.5 cm的烧杯中进行超声处理。

1.3.3 超声处理及GSPI/WPI复合蛋白凝胶的制备

参照Zhao Ruixuan等[20]的方法，在冰水浴条件下，用直径为6 mm的探头浸入溶液中，超声处理时间为5 min，其中超声时间5 s、间隔时间5 s。超声总功率为900 W，设置输出功率分别为总功率的25%、45%、65%，未超声处理的样品作为对照组（即输出功率为0 W）。用塑料薄膜将所有样品密封并在膜上扎孔，置于90 ℃水浴锅中加热30 min，将样品冷却至室温后在4 ℃下储存12 h以形成热诱导凝胶。测试前，使凝胶样品于室温下平衡2 h。

1.3.4 蛋白质溶解度测定

参照Wang Yaosong等[21]的方法测定超声处理后不同pH值条件下的蛋白溶解度。超声处理后的GSPI/WPI复合溶胶用相应pH值的柠檬酸磷酸盐缓冲液（citratephosphate buffer，CPB）稀释至10 mg/mL。在5 000×g、25 ℃条件下离心10 min后，采用双缩脲试剂测定上清液中的蛋白质量浓度。蛋白质溶解度以上清液中的蛋白质量浓度占初始总蛋白质量浓度（10 mg/mL）的比例表示。

1.3.5 蛋白表面疏水性和表面巯基含量测定

参考Shi Ruijie等[22]的方法稍加改动，用1-苯氨基萘-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作为荧光探针，对超声处理后GSPI/WPI复合溶胶的疏水性进行测定。将各复合溶胶样品分别稀释至0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。随后将20 μL ANS溶液与2 mL稀释的样品溶液充分混合，在黑暗中反应15 min。使用荧光分光光度计在365 nm激发波长和484 nm发射波长下测定荧光强度。表面疏水性用荧光强度和蛋白质量浓度之间线性回归方程的初始斜率表示。

巯基含量的测定参照Beveridge等[23]的方法并进行一些修改。超声处理后的样品用相同pH值的CPB稀释到2 mg/mL；取2 mL稀释液加入50 μL 5,5’-二硫代二硝基苯甲酸盐（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（现配现用，浓度为10 mmol/L），混合均匀后避光反应15 min，在412 nm波长处测定样品溶液的吸光度。巯基含量按下式计算。

式中：A412nm为溶液在412 nm波长处的吸光度；ρ为稀释后的蛋白质量浓度/（mg/mL）；ε为摩尔消光系数（13 600 L/（mol·cm））。

1.3.6 溶胶粒径测定

分析前将超声后的样品溶液稀释到2 mg/mL，避免高质量浓度引起多重散射。粒径分布主要基于动态光散射表征，使用粒径电位仪测定样品溶液的粒度，上样量为1 mL，折射率和吸收参数分别设置为1.33和0.1。

1.3.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

根据Laemmli[24]的方法，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析不同pH值条件下超声功率对GSPI/WPI的影响。将超声处理后的GSPI/WPI复合溶液稀释至2 mg/mL，分别加入等体积的还原剂（体积分数5%β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME））或非还原剂（0.5 mmol/LN-乙基顺丁烯二酰亚胺），混合均匀。将混合溶液煮沸3 min，冷却至室温备用。SDS-PAGE在5%（体积分数，下同）浓缩胶和12%分离胶中进行，每孔的上样量均为15 μg。

1.3.8 质构特性测定

参照He Zhendong等[25]的方法进行修改，从烧杯中取出制备的GSPI/WPI复合凝胶（高1.8 cm、直径2.0 cm），选择P/0.5的圆柱形探头测试凝胶的纹理特性。参数设定：实验前、后速率均为5.0 mm/s，测试速率为2.0 mm/s，压缩距离为7 mm，触发力为5 g，进行2 个循环的压缩实验。

1.3.9 持水性测定

参照Wang Yaosong等[26]的方法，将超声处理后的GSPI/WPI凝胶从烧杯中取出，在3 000×g、20 ℃条件下离心20 min。仔细排除上清液，记录凝胶离心前后的质量。持水性以离心后剩余凝胶质量与离心前样品初始质量的百分比表示。

1.3.10 FTIR测定

分析前，对超声处理后不同pH值的凝胶样品进行冷冻干燥。取约1 mg干燥后的样品加入100 mg溴化钾中，研磨成均匀的粉末并进行压片。用FTIR仪扫描4 000～400 cm－1范围内的FTIR光谱，分辨率设置为4 cm－1，扫描背景吸收进行基线校正。

1.3.11 微观结构观察

使用Prisma E环境扫描电子显微镜观察凝胶的微观结构。将超声处理后不同pH值的蛋白凝胶从玻璃杯中取出并切片，用双面胶固定凝胶样品，对其横截面进行喷金处理。将样品置于20 kV电子加速电压的扫描电子显微镜下观察，放大倍数为10 000 倍，观察尺度为10 μm。

1.4 数据统计与分析

所有实验重复测定3 次，用最小显著性差异法进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著，使用Statistix 9软件通过方差分析（ANOVA）对实验数据进行分析，采用Sigmaplot 10.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 复合蛋白的溶解度、表面疏水性、表面巯基含量和粒径

溶解度是影响蛋白质功能特性的一个重要参数，受到pH值的影响。如图1A所示，GSPI/WPI样品在pH 6.0条件下的溶解度整体较高，这是因为远离白果蛋白等电点（pI 4.4）后，复合蛋白带有更多负电荷，静电排斥较强，有助于蛋白质的溶解；而pH 4.0和pH 5.0更靠近等电点，静电排斥较弱，导致蛋白质溶解度降低[27]。经过超声处理后，超声波产生的空化作用可能会影响蛋白质的三级结构，使蛋白质分子展开或折叠聚集，但对于GSPI/WPI复合蛋白的溶解度影响较弱，相同pH值下超声处理样品的溶解度没有显著差异。

图1 超声对不同pH值GSPI/WPI溶解度（A）、表面疏水性（B）、表面巯基含量（C）和粒径（D）的影响Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment on the solubility (A), surface hydrophobicity (B), surface sulfhydryl group content (C) and particle size (D)of GSPI/WPI at different pH levels

表面疏水性与蛋白质的构象、大小、氨基酸组成和序列以及分子内和分子间连接有关[28]，可用于研究蛋白质三级结构的变化。如图1B所示，GSPI/WPI的表面疏水性随着pH值的升高而降低。有研究表明，酸性环境更有利于疏水氨基酸残基的暴露，从而导致亲水基团的嵌入[29]。pH值的增加使GSPI/WPI表面带有更多负电荷，这可能会引起蛋白质的自聚集，从而降低其表面疏水性。超声处理后的GSPI/WPI疏水性随着超声功率的增大而减弱，这可能是因为超声使GSPI和WPI蛋白结构展开并产生新的交联，从而使蛋白颗粒重新聚集，进而减少了疏水基团的暴露。

表面巯基对蛋白质的结构稳定性起重要的作用，可通过测定巯基含量研究蛋白的结构变化，在过氧化条件下巯基易形成二硫键，从而改善蛋白的凝胶网络结构[30]。如图1C所示，随着pH值的增加，蛋白的表面巯基含量减少，这可能是因为静电斥力的作用使蛋白结构展开、亚基解聚，蛋白内包裹的巯基被氧化为二硫键[31]。随着超声功率的增强，蛋白的表面巯基含量也随之增加，这可能是因为超声处理降低了蛋白的聚集程度，超声波空化效应冲击波破坏了GSPI/WPI复合蛋白聚集体之间的二硫键，使其断裂并形成—SH基团[20]。在超声过程中，蛋白分子的破碎、重排和聚合可能会同时发生，高强度的超声环境可能会产生新的自由基和超氧化物，从而影响表面巯基的含量。

如图1D所示，在等电点附近，蛋白质分子间的静电作用较弱，更易形成粒径较大的聚集体。而在pH 6.0时，静电斥力占主导，疏水作用较弱[32-33]，使蛋白质颗粒分散且尺寸较小。随着超声功率的升高，GSPI/WPI的粒径呈现先减小后增大的趋势。在较低功率下，超声波的高剪切力和空化作用破坏了蛋白质分子间的聚集，形成粒径较小的蛋白颗粒[34]。随着超声功率的增加，GSPI/WPI的粒径增大，高功率的超声可能会加速GSPI/WPI蛋白分子互相碰撞，促进蛋白分子间的相互作用，形成分子质量较大的聚集体。这与Jiang Lianzhou等[35]的研究中超声对黑豆分离蛋白粒径影响的结果一致，他们发现高功率的超声处理使黑豆分离蛋白聚集体重组，从而导致颗粒尺寸增加。Zhang Tiehua等[36]的研究表明，经高功率的超声处理后，转谷氨酰胺酶交联乳清蛋白的粒径明显增加，这可能是因为超声破坏了相关的非共价相互作用。

2.2 复合蛋白SDS-PAGE分析结果

如图2所示，在非还原条件下（不添加β-ME），主要条带包括GSPI中的G1和G2以及WPI中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中G1和G2条带蛋白可能分别是银杏种子中的11S豆蛋白Ginnacin和7S类豌豆球蛋白[36-37]。超声处理后条带位置未受影响，条带强度无明显变化。在不添加β-ME的条件下，观察到电泳条带的顶部出现了高分子质量的蛋白聚集体。当加入β-ME后，G1和G2条带蛋白降解，并出现低分子质量的多肽，其中G1条带蛋白分裂成G4和G5条带蛋白。Ginnacin是一种六聚体蛋白，类似于其他豆科蛋白，每个亚基由一个酸性多肽（G5）和一个碱性多肽（G4）组成，两者通过二硫键形成共价连接。在非还原条件下，Ginnacin在SDS-PAGE中的分子质量为49 kDa，而还原后其酸性亚基和碱性亚基分子质量分别为约28 kDa和约20 kDa[19]。G2条带蛋白在还原条件下（添加β-ME）也产生了酸诱导降解，电泳条带顶部的大分子聚集体消失，可能是二硫键被氧化后断裂，大分子降解成低分子质量多肽所致。

图2 超声处理及不同pH值条件下GSPI/WPI的SDS-PAGE图谱Fig. 2 SDS-PAGE patterns of ultrasound-treated GSPI/WPI at different pH levels

2.3 复合蛋白凝胶的质构特性

通过单轴双压缩实验研究不同超声功率处理下不同pH值GSPI/WPI凝胶的质地属性（包括硬度、弹性、黏聚性、胶黏性、咀嚼性和回复性）（图3）。凝胶的硬度是指在第一次压缩循环期间测得的最大阻力，pH 4.0条件下的GSPI/WPI凝胶强度明显弱于pH 5.0、6.0。超声处理后，不同pH值条件下蛋白凝胶的强度随超声功率的增加而增强。超声功率为65%时，pH 5.0的凝胶硬度从83 g增加到164 g，pH 4.0的凝胶硬度是未超声组的2.7 倍。凝胶的口感与嚼劲反映了其食品性能，因此与硬度高度相关。弹性为凝胶在减压后恢复其原始形状的能力。pH 4.0条件下的蛋白凝胶弹性较差，但随着超声功率的增加，其弹性明显增大。黏聚性为凝胶在两次连续压缩期间保持其整体网络结构的能力[38]。GSPI/WPI蛋白凝胶的回复性和黏聚性也随超声功率的增大而呈现增大趋势。

图3 超声对不同pH值条件下GSPI/WPI热诱导凝胶质构特性的影响Fig. 3 Effect of ultrasonic treatment on texture properties of heat-induced GSPI/WPI gel at different pH levels

GSPI/WPI热诱导凝胶特性受pH值影响的原因是凝胶内部网络结构的改变。有研究表明，WPI在低pH值条件下会形成刚性的细股网络，在高pH值条件下则会形成柔性的弯曲股网络[39]。当溶液的pH值接近蛋白等电点时，弱的静电斥力会使其形成颗粒凝胶，与细链凝胶相比，松散的颗粒凝胶间连接较少，形成的凝胶硬度和弹性较差。超声处理有效提高了GSPI/WPI复合凝胶的硬度、弹性和咀嚼性。超声波带来的空化作用使复合凝胶形成了更加紧密均匀的凝胶网络，暴露的疏水残基有利于蛋白质分子间的相互作用，从而提高了其凝胶强度[40]。Alting等[41]的研究表明，巯基含量在决定葡萄糖酸内酯诱导的WPI凝胶强度中起主导作用。本研究发现，随着超声功率的增大，游离巯基的含量增加，与凝胶强度的变化趋势相印证。综上，超声影响了GSPI/WPI间的分子结构，从而改善了复合蛋白凝胶的质构特性。

2.4 复合蛋白凝胶的持水性

如图4所示，超声处理后，不同pH值条件下GSPI/WPI凝胶的持水性差异较大。有研究表明，蛋白质在等电点处形成的颗粒凝胶孔隙较大，截留水的能力较弱，而细链凝胶结构更均匀，所以拥有更好的持水性[42]。随着超声功率的增加，GSPI/WPI凝胶的持水性也有所提升，超声波带来的空化效应使蛋白结构产生改变。加热过程中，蛋白质的共价键与非共价键共同作用，形成具有一定三维网络结构的体系，而超声引起巯基含量的增加，更有利于蛋白质间的相互作用。加热过程中，游离巯基形成新的二硫键，也因此增强了复合凝胶的硬度[43]。

图4 超声对不同pH值条件下GSPI/WPI复合凝胶持水性的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic treatment on water-holding capacity of GSPI/WPI composite gel at different pH levels

2.5 复合蛋白凝胶的FTIR分析

如图5所示，超声没有使GSPI/WPI光谱图引入新的峰，这意味着复合凝胶中没有形成新的共价键。3 600～3 100 cm－1处有较宽的吸收峰，对应羟基—OH键和氢键的伸缩振动。2 960 cm－1附近的峰反映C—H基团的伸缩振动。此外，还可以观察到1 640、1 530 cm－1和1 230 cm－1处的典型蛋白质吸收峰，分别对应蛋白质的酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带[44]，这可以用来表征蛋白质中氢键的强度和所形成二级结构的类型。经过高功率的超声处理后，—OH伸缩振动的吸收带向较低的波数（约3 300 cm－1）转移，这表明超声使两种蛋白分子之间的羟基相互作用增强，从而形成氢键，与2.3节复合凝胶质构特性的变化相符合，即超声使凝胶硬度增加。在pH 5.0条件下，相比于没有经过超声处理的GSPI/WPI复合凝胶，超声导致FTIR图谱中酰胺I带（1 640 cm－1）强度增大，且向更高的波数（1 644 cm－1）移动，表明超声改变了蛋白的空间结构，使蛋白的二级结构发生改变，从而使其交联程度提高[45-46]。

图5 超声处理及不同pH值条件下GSPI/WPI凝胶的FTIR图谱Fig. 5 FTIR spectra of GSPI/WPI gel formed with ultrasonic treatment at different pH levels

2.6 复合蛋白凝胶的微观结构分析

如图6所示，通过扫描电子显微镜可以观察超声处理后不同pH值条件下GSPI/WPI复合凝胶放大后的微观结构，从微观水平上表征蛋白质凝胶的形貌。pH 4.0条件下的GSPI/WPI复合凝胶展现出较为光滑的凝胶网络结构，这是因为静电斥力的作用促进了蛋白质的展开。而pH 5.0、6.0条件下GSPI/WPI复合凝胶更靠近等电点，呈现出明显的颗粒结构，由粗聚集体球形颗粒组成。超声处理后，复合凝胶的蛋白结构因为超声波的空化作用而展开，因此分布得更加紧密均匀，孔隙更小，这有助于凝胶中蛋白质对水分子的捕捉，也解释了其持水性增加的原因。pH 5.0条件下的复合凝胶在超声作用下呈现出明显的网络聚集，蛋白质之间的相互作用增强，随着超声功率的增加，蛋白质形成分子质量更大的聚集体，这与超声后复合蛋白粒径增大的现象相印证。

图6 超声处理及不同pH值条件下GSPI/WPI凝胶的微观结构Fig. 6 Microstructure of GSPI/WPI gel formed with ultrasonic treatments at different pH levels

3 结 论

GSPI/WPI复合物在超声处理后蛋白结构及溶胶的物化特性和凝胶性均有较为明显的变化，这些变化与复合物的pH值也有一定的关联。在较低的pH值条件下（pH 4.0），超声处理显著降低了蛋白疏水性，提高了其表面巯基含量，促进了蛋白聚集，在此pH值条件下所形成的凝胶质地均匀细腻且持水性得到显著提升，但成胶性较差。在较高的pH值条件下（pH 5.0和pH 6.0），超声处理对蛋白复合物的溶解度、表面疏水性无显著影响，但显著提高了复合物的表面巯基含量和粒径，所形成的凝胶质地粗糙，但pH 5.0时凝胶具有较好的质构特性和较高的持水性。GSPI/WPI复合物的物性（表面巯基含量和粒径）和凝胶功能性随着超声强度的增加而显著提升。综上，将超声处理与pH值调控结合可有效调控复合蛋白的凝胶特性，本研究可为其功能性的改造提供技术支持和理论依据。