体外消化对β-胡萝卜素大豆分离蛋白纳米颗粒黏液层渗透及跨膜转运的影响机制

陈 羚，吕 园，徐菲菲，钟 芳,*

（1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学未来食品科学中心，江苏 无锡 214122；3.江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122；4.嘉兴未来食品研究院，浙江 嘉兴 314050）

蛋白质纳米载体已被证实能够有效改善脂溶性营养素（例如β-胡萝卜素（β-carotene，BC））的生物利用率。然而，由于严苛的胃肠道环境、肠道黏液层屏障以及小肠上皮的跨膜限制，纳米载体的口服递送效果仍受到质疑[1]。大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）基纳米颗粒被认为是包载BC的理想载体，具有良好的生物相容性和可再生性。本课题组先前的研究发现，在经口吸收过程中，蛋白质载体容易受到极端胃肠条件的影响，界面蛋白发生水解，使得BC的疏水内核暴露于水相中；同时，肠液中的胆盐、磷脂等小分子活性剂会吸附到疏水内核表面，对BC进行再包埋，形成由蛋白水解肽、胆盐、磷脂、BC内核共同组成的尺寸在100 nm以下的重构载体[2]。尽管这类重构载体在胃肠道中的稳定性较差，但在小鼠血浆中显示出良好的转运吸收效率[3]。

胃肠道消化过程中的载体结构转变可能影响载体在小肠上皮细胞的转运效率和转运模式。Ma Yuhua等报道，在消化过程中与胆盐相互作用的脂质纳米粒与消化前的微粒相比，可以将水飞蓟宾的生物利用度显著提高7～8 倍[4]。Akbari等研究了从油菜籽中提取的蛋白质所制备姜黄素纳米颗粒在消化前后内吞形式的变化，发现消化前细胞摄取纳米颗粒的主要形式是网格蛋白依赖的内吞作用和小窝蛋白介导的内吞作用，消化后细胞摄取纳米颗粒的主要形式是小窝蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用[5]。也有文献报道经胆盐修饰的纳米颗粒可以促进其在黏液层的渗透性[6]。

本研究构建载有BC的SPI纳米颗粒，通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、纳米粒度仪和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪对纳米载体的形貌、粒度以及包封率等基本性质进行考察。进一步地，通过构建体外模拟消化模型，获取消化后的重构纳米载体，并对其基本结构特性进行分析。最后，采用人体结肠癌细胞系（Caco2）的分化模型与HT29细胞系共培养，模拟小肠上皮细胞的黏液层和紧密细胞膜结构，以评估消化后重构纳米载体在黏液层中的渗透性以及在小肠上皮细胞中的转运效率和转运模式。旨在探讨消化过程对蛋白质纳米载体结构的影响以及重构纳米载体突破黏液层和跨膜转运双重吸收屏障的能力及可能机制，以期为进一步明确纳米载体口服递送的有效性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI、磷钨酸盐、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二巯基苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、荧光素钠、阿利新兰、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）、无水乙醇（分析纯） 中国国药集团上海化学试剂公司；BC（纯度＞97%） 东京化学工业有限公司；猪胰蛋白酶（8×USP）、猪胆汁提取物（B8631）美国Sigma-Aldrich公司；人体结肠腺癌细胞（Caco2）、人体结肠腺癌杯状细胞（HT29） 美国ATCC细胞库；Hank’s缓冲液（Hank’s balanced salt solutions，HBSS）、高糖培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、双抗、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、非必需氨基酸（100×） 美国GIBCO公司；奥全健肠溶空囊 山西广生胶囊有限公司；乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙腈、甲基叔丁基醚（色谱级） 上海泰坦科技股份有限公司；超纯水 屈臣氏有限公司；总胆汁酸（total bile acid，TBA）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

ME104E电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DF-101S恒温式加热磁力搅拌器 巩义市俞华仪器有限公司；T25型高速分散机 德国IKA公司；N-EVAP-24氮吹仪 美国Organomatio公司；2695 HPLC仪、2998光电二极管阵列（photo-diode array，PDA）检测器 美国沃特世科技有限公司；ChemiDoc XRS＋化学发光凝胶成像系统 美国伯乐公司；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪 英国马尔文公司；Avanti JXN-26高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特公司；Tecnai 12 TEM 美国FEI电子光学有限公司；Millicell ERS-2细胞电阻仪 美国Millipore公司；Q700超声波破碎仪 美国Qsonica Misonix公司；5430高速离心机、CellXpert C170二氧化碳培养箱 德国Eppendorf公司；M2全波长酶标仪 美国Molecular Devices公司；CKX53倒置显微镜 日本奥林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BC-SPIs的制备及性质表征

1.3.1.1 载有BC的SPI纳米颗粒的制备

将SPI溶于超纯水中配制成质量分数2%的SPI溶液，在室温下搅拌2 h以确保SPI完全水合，随后在85 ℃水浴中加热10 min促进其自组装。然后在15 000×g下离心10 min后收集上清液，即为纳米颗粒（SPIs）溶液。将BC（溶解后质量浓度为0.1 g/100 mL）溶解在乙酸乙酯中，在50 ℃水浴中搅拌20 min，同时加入二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）（每100 mL乙酸乙酯中添加0.1 g）以防止BC氧化分解，得到BC有机相溶液。使用8 000 r/min的高速分散机分散SPIs水溶液，同时将BC有机相溶液逐滴滴加到SPIs溶液中，获得BC、纳米粒子质量比为1∶200的纳米颗粒溶液并继续高速分散4 min。最后使用氮吹仪除去溶液中的乙酸乙酯，得到质量浓度为20 mg/mL的BC-SPIs颗粒分散液用于后续研究。

1.3.1.2 粒径测定

参考Chen Ling等的方法[7]，使用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定消化前和消化期间BC-SPIs样品的平均粒径和粒径分布情况。取消化前及消化期间100 μL的样品，使用10 mL的PBS（0.02 mol/L、pH 7.0）进行稀释。测定时设定BC-SPIs的相对折射率为1.09，所有的测试在25 ℃下进行。

1.3.1.3 Zeta电位测定

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定BC-SPIs消化前和消化期间的Zeta电位。使用PBS（0.005 mol/L、pH 7.0）稀释样品100 倍，于室温下测定其Zeta电位。

1.3.1.4 形貌观察

使用TEM对BC-SPIs进行形貌观察[8]。利用去离子水将BC-SPIs和SPIs均稀释到0.1 mg/mL，然后滴在涂有碳的300 目铜格上，静置5 min后吸去多余液体。用磷钨酸盐溶液（10 mg/mL）染色样品30 s。最后将铜网放置在干燥器中室温干燥一夜，利用TEM在120 kV下观察样品。

1.3.1.5 BC-SPIs中BC的包封率测定

BC-SPIs中BC的包封率测定参考文献[9]。取1 mL BC-SPIs颗粒分散液样品，15 000 r/min离心20 min，除去游离的BC。转移0.5 mL上清液到玻璃试管中，加入2 mL乙酸乙酯，涡旋1 min，确保两相充分混合后在5 000×g下离心5 min。随后，将含有BC的有机层转移至10 mL容量瓶中。上述操作重复多次直至上层清液无色，再在容量瓶中加入乙酸乙酯定容至10 mL。

使用配备有2998 PDA检测器的HPLC系统对样品中的BC质量浓度进行定量分析。色谱柱为COSMOSIL C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配备有预柱。HPLC条件如下：流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；检测波长：450 nm；分析时间：28 min；流动相：A相为V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（超纯水）＝84∶14∶2，B相为二氯甲烷；梯度洗脱程序：0～15 min，80% A、20% B线性变化到45% A、55% B；15～20 min，45% A、55% B；20～25 min，45% A、55% B线性变化到80% A、20% B；25～28 min，80% A、20% B。利用标准曲线方程计算BC质量浓度，按公式（1）计算BC-SPIs对BC的包封率。

1.3.2 模拟消化模型构建及性质测定

1.3.2.1 模拟小肠消化模型构建

参照Chen Ling等的方法构建模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）消化体系[2]，并对BC-SPIs在SIF中的消化行为进行探究。

配制20 mL SIF（pH 7.0、0.1 mol/L PBS，含8 mg/mL胆盐、1 mg/mL胰蛋白酶、5 mmol/L氯化钙），在37 ℃酶解罐中孵育5 min。将BC-SPIs冻干为粉末，在100 mg的肠溶片空壳中加入400 mg BC-SPIs粉末，在20 mL去离子水中加入2 g BC-SPIs肠溶片，并与20 mL SIF混合，温度设置为37 ℃，100 r/min搅拌速率下消化2 h。

对消化过程中BC-SPIs的界面蛋白组成、Zeta电位及其胆盐吸附情况进行测定。

1.3.2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

参考文献[9]，使用质量分数12%的分离胶和5%的浓缩胶对消化过程中的BC-SPIs进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。将样品与上样缓冲液（含14.4 mmol/L的β-巯基乙醇）混合，使蛋白质的终质量浓度为8 mg/mL。将混合物在沸水中加热5 min后于12 000×g离心10 min，去除沉淀。在凝胶的每孔中加入10 μL样品，浓缩电压和分离电压设置为200 V。当样品距离底面约0.5 cm时，停止反应。使用0.1 g/100 mL的考马斯亮蓝R-250溶液染色凝胶60 min，用含体积分数22.5%甲醇和5%醋酸的脱色液对凝胶脱色。使用凝胶成像系统对凝胶进行扫描。

1.3.2.3 表面胆盐吸附测试

参照Naumann等的方法[10]，将2 mL SIF消化液消化2 h后的样品（1.3.2.1节制备）转移到透析袋内（截留分子质量1 000 Da），置于48 mL的PBS（50 mmol/L、pH 7）中。在37 ℃、150 r/min条件下使用振荡水浴透析24 h。根据总胆汁酸试剂盒说明书测定透析前消化液和透析外液中的胆盐质量浓度，表面胆盐吸附率按公式（2）计算。

1.3.3 消化前后BC-SPIs的细胞跨膜转运途径分析

1.3.3.1 细胞培养

使用人体结肠腺癌细胞（Caco2）和人体结肠腺癌杯状细胞（HT29）第7～19代进行实验。将细胞培养于含有10 mL完全培养基（体积分数10% FBS、1%非必需氨基酸和体积分数1%双抗）的细胞培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中，温度设置为37 ℃，CO2的体积分数为5%。当细胞的汇合程度达到80%～90%时（＜4 d），使用0.25%胰蛋白酶进行细胞传代。

1.3.3.2 Caco2细胞模型的建立

将Caco2细胞培养3～5 代后，根据文献[11]的方法，将Caco2细胞以1×105个/cm2的密度接种到6 孔Transwell膜（直径15 mm、孔径0.4 μm）上，每2 d换一次培养液，培养约21 d左右分化形成细胞单层。

1.3.3.3 Caco2/HT29共培养细胞模型的建立

根据Song Hongdong等的方法[12]，将Caco2和HT29以9∶1的密度比按1×105个/cm2的密度接种到6 孔Transwell膜上，每2 d换一次培养液，培养约21 d左右形成含黏液层的细胞单层。

1.3.3.4 细胞跨膜电阻的测定

使用电阻仪测定细胞模型在21 d的培养分化过程中细胞跨膜电阻的变化[11]，在每次更换培养基后进行测定。细胞跨膜电阻按公式（3）计算。

式中：RS为Caco2细胞或Caco2/HT29共培养细胞单层模型的电阻/Ω；RB为聚碳酸酯多孔膜在培养基中的自身电阻/Ω；A为有效膜面积（4.52 cm2）。

1.3.3.5 荧光素钠渗透实验

以DMEM为溶剂制备2 mg/mL的荧光素钠溶液。使用HBSS清洗Caco2或Caco2/HT29共培养21 d的细胞模型两遍，在细胞培养室顶端（apical，AP）加入1.5 mL 2 mg/mL的荧光素钠溶液，底端（basolateral，BL）加入2 mL DMEM，在37 ℃下孵育4 h，每隔一段时间吸取适量的BL端溶液，并补充新的DMEM溶液。使用酶标仪在激发波长440 nm、发射波长525 nm下测定BL端培养基中荧光素钠的荧光强度。用DMEM稀释2 mg/mL的荧光素钠溶液并测定其荧光强度获得标准曲线。同时，以空白聚碳酸酯多孔膜作对照，按公式（4）计算荧光素钠透过率，并以此判断细胞模分化后的完整性。

1.3.3.6 细胞膜分化程度的考察

细胞顶端碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力可以表征Caco2细胞膜的分化成熟程度[11]。使用ALP试剂盒测定1～21 d内细胞培养室AP和BL培养基中的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力，以AP、BL培养基中的ALP活力比值（AP/BL比值）判断细胞膜的分化程度。

1.3.3.7 阿利新蓝染色实验

阿利新蓝是一种对黏液中的黏蛋白具有特殊染色作用的染色剂，可用于直观评价黏液细胞的存在情况[13]。将细胞以0.8×105个/mL的密度接种于6 孔板中。染色前使用PBS清洗细胞2 次，然后加入0.5 mL 4%（体积分数）多聚甲醛溶液固定细胞，37 ℃孵育30 min后吸出，再使用PBS清洗细胞2 次，加入含有1%（质量分数）阿利新兰的3%（体积分数）乙酸溶液，37 ℃孵育30 min后，用PBS洗去多余的阿利新蓝。用倒置显微镜观察在7、14 d和21 d的黏液染色情况。

1.3.3.8 细胞毒性实验

采用MTT法对消化前后的BC-SPIs进行细胞毒性测定[14]。用PBS配制5 mg/mL的MTT溶液。在96 孔板孔中加入100 μL浓度为5.0×105个/mL的细胞液，37 ℃孵育12 h左右，使每个孔的细胞汇合程度达到40%左右进行后续实验。先使用PBS简单清洗细胞两遍，然后加入不同稀释倍数的样品（2、5、10、20、40、80 倍和100 倍），37 ℃孵育4 h。移去培养基，再用PBS清洗细胞，加入100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），于37 ℃孵育2 h。移去培养基，再用PBS清洗细胞，并加入100 μL二甲基亚砜，振荡96 孔板5 min，使MTT紫色结晶完全溶解，使用酶标仪检测每孔细胞在490 nm波长处的光密度值（OD值），按公式（5）计算细胞存活率。

式中：空白组为不接种细胞的空白孔；对照组为不添加BC-SPIs、仅接种细胞的孔。

1.3.3.9 两种细胞模型对BC的转运与吸收的考察

使用生长分化21～28 d的Caco2和Caco2/HT29共培养细胞模型对消化前后BC-SPIs的转运与吸收进行考察[11]。方法如下：使用DMEM溶液清洗AP端细胞2 次，再在AP端加入用DMEM稀释过的样品1.5 mL（BC质量浓度控制在4.4 μg/mL），在BL端加入2 mL DMEM。在37 ℃下孵育，在此期间使用跨膜电阻仪定时测定AP端和BL端之间区域的电阻，确保在整个孵育过程中细胞膜能够保证完整性（不低于250 Ω·cm2）。孵育4 h后，收集AP端DMEM溶液，加入0.5 mL 4 ℃含体积分数10%乙醇溶液的PBS终止实验，分别收集BL端的DMEM溶液和Transwell膜上的单层细胞。使用HPLC法测定搜集的3 个部分中的BC及其代谢产物的含量。其中，BL端DMEM中BC或其代谢产物的含量是转运量；细胞层中BC或其代谢产物的含量是积累量；求BC及其代谢产物总含量时将其均转化为VA当量后再求和，以此表征总积累量，即积累的VA当量。

1.3.3.10 BC的代谢产物定量分析

使用细胞刮棒获得0.5 mL细胞悬液。其中，0.4 mL用于定量BC及其代谢产物含量。剩余的0.1 mL用于使用BCA法测定蛋白质含量。

BC和视黄醇棕榈酸酯定量的HPLC方法同1.3.1.5节。视黄醇和维生素A酸含量采用HPLC法进行定量[15]，具体条件如下：色谱柱为COSMOSIL C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配备有预柱；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；检测波长：450 nm或325 nm；分析时间：36 min；样品室温度：4 ℃；流动相：A相（70%（体积分数，下同）乙腈＋10%甲基叔丁基醚＋20%乙酸铵（80 mmol/L、pH 4.5））和B相（76%乙腈＋20%甲基叔丁基醚＋4%乙酸铵水溶液（80 mmol/L、pH 4.5））；梯度洗脱程序：0～3 min，100% A；3～10 min，从100% A、0% B线性变化到25% A、75% B；10～25 min，从25% A、75% B线性变化到0% A、100% B；25～27 min，100% B；27～29 min，从0% A、100% B线性变化到100% A，0% B；29～36 min，保持100% A。

1.3.3.11 黏液层渗透性考察

将细胞以0.8×105个/mL的密度接种于6 孔板中，使用生长分化14 d的HT29细胞模型对消化前后BC-SPIs的黏液层渗透率进行考察。方法如下：移去DMEM培养基，再向孔中加入用DMEM稀释过的2 mL样品（BC质量浓度控制在4.4 μg/mL）。在37 ℃下孵育4 h后，移去孔中培养基，使用4 ℃的PBS清洗黏液2 遍。使用0.5 mL 4 ℃含体积分分数10%乙醇的PBS终止实验，收集单层细胞。使用HPLC法定量测定细胞中BC及其代谢产物的含量，求总含量时将其转化为VA当量，即为透过黏液层的VA当量。

1.3.3.12 BC-SPIs转运模式分析

通过将细胞与特定的内吞作用抑制剂预孵育以探究消化前后BC-SPIs的细胞膜转运模式[5]。1.5 mL Caco2细胞以0.8×105个/mL的密度接种在6 孔板孔中，并孵育至完全汇合。去除培养基，然后加入2 mL使用完全DMEM制备的氯丙嗪（20 μg/mL）、槲皮素（20 μg/mL）、吲哚美辛（100 μg/mL）、β-环糊精（2 mg/mL）和阿米洛利（40 μg/mL）抑制剂溶液，在37 ℃孵育1 h。随后，将2 mL消化前或消化后的BC-SPIs（以DMEM稀释，BC质量浓度控制在4.4 μg/mL）添加到孔板中，在37 ℃下孵育4 h。同时，为研究BC-SPIs是否以主动转运模式吸收，将上述实验操作过程中的两次孵育温度均改成4 ℃。孵育后使用PBS洗涤BC-SPIs和抑制剂，加入1 mL PBS，收集细胞。使用细胞超声破碎仪破碎细胞组织。在细胞破碎液中按体积比1∶1加入含0.1 g/100 mL BHT的四氢呋喃溶液，涡旋1 min，再加入1 mL乙酸乙酯，继续涡旋1 min，于5 000×g离心5 min，收集上层淡黄色有机相于玻璃试管中，重复上述萃取过程至少3 次以确保BC及其相关代谢产物萃取完全。收集的有机相用氮气吹干，再溶于200 μL含0.1 g/100 mL BHT的正己烷中。采用HPLC法测定BC及其代谢产物的含量，并将其转化为VA当量以计算BC的相对吸收率，如式（6）所示。

通过改变SIF中胆盐和胰蛋白酶的添加情况，探究模拟肠消化中不同消化条件因素对BC-SPIs转运模式的影响。具体条件如下：1）不消化，直接考察Caco2细胞对BC-SPIs的转运途径（消化前组）；2）考察SIF消化对Caco2细胞转运BC-SPIs方式的影响（消化后组）；3）考察肠消化过程中胰蛋白酶对Caco2细胞转运BC-SPIs方式的影响：SIF中不添加胆盐（胰蛋白酶组）；4）考察肠消化过程中胆盐对Caco2细胞转运BC-SPIs方式的影响：在SIF中不添加胰蛋白酶（胆盐组）。

收集上述消化条件下的BC-SPIs，依照1.3.3.12节的方法对其转运模式进行考察。

1.4 数据处理与分析

所有实验至少重复3 次，数据结果表示为平均值±标准差，使用SPSS Statistics Version 22.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），以Duncan检验法进行显著性分析（P＜0.05表示差异显著）。采用Graphpad 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 BC-SPIs结构特性表征

如表1所示，SPIs的多分散系数（polydispersity index，PDI）为0.39，粒径分布较为均一，其电位低于－20 mV，表明其颗粒稳定性较高。包封BC后，平均粒径较包封前有所增大，可能是因为BC被包埋进入到颗粒内部，使颗粒膨胀。Chen Feiping等的研究中也观察到BC-SPIs在与姜黄素络合后粒径增大的现象[16]。BC-SPIs电位的绝对值较包封前有所提高，说明载入BC后纳米颗粒整体稳定性有了进一步提高。BC-SPIs中BC的包封率为40.21%，与其他报道结果相比有所提高，李炳章等采用真空冷冻干燥技术制备出以SPI为载体的姜黄素纳米颗粒，包封率仅为33.90%[17]。

表1 BC-SPIs的平均粒度、PDI、Zeta电位和包封率Table 1 Average diameter, polymer dispersity index (PDI), zeta potential and encapsulation efficiency of BC-SPIs

使用TEM进一步观察BC-SPIs的形貌结构，结果如图1所示。BC-SPIs形态呈球形颗粒。比较发现，利用纳米粒度及Zeta电位分析仪测得的BC-SPIs平均粒径比TEM图像中观察到的更大，这是因为TEM观察的是干燥状态下的颗粒形貌，而米粒度及Zeta电位分析测量的是颗粒在溶液中的尺寸[18]。在水溶液中，颗粒的表面存在水化层，在TEM干燥制样的过程中，水分蒸发会破坏水化层，使颗粒失水皱缩，导致尺寸变小[19]。

图1 SPIs（A）及BC-SPIs（B）的TEM图像Fig. 1 Transmission electron microscopic image of SPIs (A) and BC-SPIs (B) nanoparticles

2.2 BC-SPIs在消化过程中的结构特性变化

2.2.1 消化过程中BC-SPIs的粒径变化

如图2所示，在SIF消化的整个过程中，BC-SPIs粒径逐渐增大，这是因为SIF消化液中存在的胰蛋白酶使BC-SPIs界面蛋白上的赖氨酸残基、精氨酸残基等被切断，界面蛋白层被破坏，使疏水基团暴露，分子发生聚集，形成大的聚集体，导致粒径上升，并在随后的消化过程中结构继续展开，使颗粒不断聚集，粒径持续增大[20]。同时，BC-SPIs在与SIF消化液混合0 min时的粒径明显增大，这是因为消化液的高离子浓度造成纳米颗粒表面电荷降低，从而发生了颗粒的部分聚集。

图2 消化过程中BC-SPIs的平均粒径变化Fig. 2 Changes in average diameter of BC-SPIs during digestion

2.2.2 消化过程中BC-SPIs的界面蛋白组成、Zeta电位及其胆盐吸附情况

如图3A所示，在SIF消化的过程中，BC-SPIs的界面蛋白在消化的前5 min内，蛋白条带密度明显下降，降解后的条带主要集中在分子质量低于37 kDa的区域内，印证了2.2.1节中颗粒粒径的增大。消化后的蛋白水解产物易与胆盐发生疏水相互作用，结合水相中的游离胆盐[21]，而带不同负电的胆盐在颗粒表面的吸附会改变颗粒的表面电荷[22]。如图3B所示，经过SIF消化后，BC-SPIs的表面Zeta电位绝对值增加，电位变化越大，说明界面蛋白被胆盐取代的程度越高。通过透析法测定了消化后胆盐在BC-SPIs表面上的吸附情况，结果表明消化液中有56.37%的胆盐吸附于BC-SPIs消化2 h后的颗粒表面。

图3 消化过程中BC-SPIs的SDS-PAGE（A）以及Zeta电位（B）的变化Fig. 3 Changes in SDS-PAGE (A) and zeta potential (B) of BC-SPIs during digestion

2.3 消化前后BC-SPIs的黏液层渗透及细胞跨膜转运的考察结果

2.3.1 利用Caco2单层细胞模转运模型考察的结果

2.3.1.1 细胞跨膜电阻和荧光素钠渗透性

细胞跨膜电阻反映的是细胞模型在分化时细胞间连接的紧密程度，可用于表征细胞膜的完整性，电阻高于250 Ω·cm2代表细胞膜紧密程度良好。如图4A所示，Caco2细胞模型在培养分化21 d后跨膜电阻达到890.44 Ω·cm2，说明细胞膜紧密程度高，适用于吸收转运实验[23]。

图4 孵育21 d内Caco2细胞跨膜电阻（A）以及荧光素钠透过率（B）的变化Fig. 4 Changes in trans-epithelial electrical resistance (TEER) (A) and fluorescein sodium transport rate (B) of Caco2 monolayer during 21 days of incubation

荧光素钠（分子质量为376 Da）渗透性可用以表征单层细胞膜的紧密连接程度。如图4B所示，在前15 min内就已有大量荧光素钠穿透空白膜（对照），而Caco2细胞模型在孵育4 h后也仅有2.59%的荧光素钠通过细胞膜，说明细胞膜致密程度良好。

2.3.1.2 细胞膜的分化程度

除了单层膜的紧密程度和完整性，其顶端功能酶系的发育程度也是考察单层膜是否适合评价化合物转运吸收的另一项重要指标[11]。在孵育分化过程中，Caco2单层细胞膜AP端酶系会逐渐成熟，直至酶活力不变。尽管平行样品间酶活力的基础值有所差异，但由于BL端的酶活力在孵育期间相对稳定，故可用AP端与BL端ALP活力的比值（AP/BL比值）来评价单层细胞膜的分化程度。如图5所示，在培养分化的过程中，AP/BL比值随着培养时间的延长逐渐增加，在19 d时达到比较稳定的状态，表明单层细胞膜顶端酶系的生长已经成熟，顶端酶系不再发生变化。

图5 孵育21 d内Caco2细胞膜顶端ALP活力的变化Fig. 5 Changes in alkaline phosphatase activity of Caco2 monolayer during 21 days of incubation

2.3.1.3 BC-SPIs细胞毒性考察

Narain等报道胆盐分子在胃肠道中作为阴离子表面活性剂，某些浓度下会表现出细胞毒性[24]，说明消化液中胆盐的存在会提高消化产物的细胞毒性，而本实验消化后样品中含有游离的胆盐分子，因此有必要先进行安全实验再进行后续实验。如图6所示，以细胞存活率不低于75%作为标准，确定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀释倍数为5 倍，消化后产物安全的最低稀释倍数为10 倍。消化液中BC质量浓度经HPLC定量为44 μg/mL，根据消化后产物的安全稀释倍数确定Caco2细胞模型中BC最高添加量为4.4 μg/mL。

图6 BC-SPIs在消化前（A）、后（B）的Caco2细胞毒性Fig. 6 Cytotoxicity of BC-SPIs before (A) and after (B) digestion to Caco2 cells

2.3.2 利用Caco2-HT29共培养细胞模型的考察结果

2.3.2.1 细胞跨膜电阻和荧光素钠渗透性

如图7A所示，Caco2/HT29共培养的细胞模型在21 d后细胞跨膜电阻为720.44 Ω·cm2，低于Caco2细胞跨膜电阻。这是因为Caco2细胞之间能非常紧密地连接，而HT29细胞会改变细胞的连接程度导致跨膜电阻降低[25]。Caco2/HT29细胞跨膜电阻大于130 Ω·cm2，被认为细胞单层连接较为紧密，能够形成致密的单层细胞模型[22]。

如图7B所示，Caco2/HT29共培养细胞模型在孵育4 h后，仅有3.38%的荧光素钠通过细胞膜，远低于空白的聚碳酸酯膜（对照），这说明经过Caco2/HT29共培养细胞模型细胞膜致密，可用于后续研究。

2.3.2.2 细胞膜顶端ALP活力

由图8可知，在21 d的培养过程中，AP/BL比值在17 d时达到稳定，表明在共培养细胞模型的顶端酶系已经成熟，未受到黏液层的影响。

图8 孵育21 d内Caco2-HT29共培养模型顶端ALP活力的变化Fig. 8 Changes in alkaline phosphatase activity of Caco2-HT29 co-culture during 21 days of incubation

2.3.2.3 黏液层染色实验结果

为了确认HT29细胞在共培养细胞模型黏液层中的形成，使用阿利新蓝对不同生长阶段的单层细胞表面进行染色。如图9所示，Caco2细胞中只能检测到极为少量的黏蛋白。而对于HT29细胞，无论是单独培养还是和Caco2细胞共培养，都可以分泌大量的黏蛋白。在HT29细胞单独培养时，培养14 d时黏液的分布就已经很均匀，而共培养模型则在21 d时黏液量最多，形成了含有黏液层的小肠上皮细胞跨膜模型。

图9 孵育21 d内Caco2、HT29以及Caco2-HT29共培养细胞的黏液分泌情况Fig. 9 Mucus secretion of Caco2, HT29 and Caco2-HT29 co-culture during 21 days of incubation

2.3.2.4 BC-SPIs细胞毒性考察

如图10所示，其结果与Caco2细胞毒性实验结果一致，以细胞存活率不低于75%作为标准，确定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀释倍数为5，消化后产物安全的最低稀释倍数为10。最终确定后续实验时Caco2-HT29共培养模型中的BC添加量统一为4.4 μg/mL。

2.3.3 利用Caco2-HT29共培养细胞对BC-SPIs的吸收、转运效率考察结果

2.3.3.1 BC-SPIs的细胞吸收

如表2所示，细胞内BC的代谢产物主要是视黄醇和视黄醇棕榈酸酯，而维生素A酸和BC只占很少一部分。消化后BC-SPIs在Caco2-HT29共培养细胞内的BC及其代谢产物积累量显著高于消化前颗粒。2.2.2节中已证实BC-SPIs在消化后表面上吸附了大量的胆盐分子。有研究表明胆盐修饰可以通过降低肠道黏液层的黏度和弹性促进颗粒的黏液层渗透性[26]；同时有研究表明，还可通过增强生物膜流动性和通透性、降低细胞间紧密连接程度、抑制其外排作用等特性促进携带营养素的纳米颗粒在小肠上皮细胞膜的吸收[27]。

表2 消化前后BC-SPIs中BC及其代谢产物在Caco2-HT29共培养细胞中的积累量Table 2 Cellular accumulation in Caco2-HT29 co-culture of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.3.2 BC-SPIs的转运

表3所示的是消化前后的BC-SPIs在Caco2-HT29共培养模型中的转运情况，整体来看，经过细胞代谢进入体循环的BC及其代谢产物的分布规律与细胞中积累的规律基本一致，代谢产物仍主要为视黄醇和视黄醇棕榈酸酯。对比未被消化的BC-SPIs，消化后在细胞中以及BL端检测到的BC及其代谢产物更多（表2、3）。上述研究结果表明BC-SPIs在消化过程中发生的结构转化改善了转运吸收效率，一方面可能是因为胆盐在颗粒表面的吸附突破了黏液层屏障，增加了颗粒的黏液层渗透性；另一方面也可能是因颗粒结构改变引起转运模式的变化，从而提高了其转运效率。为了验证上述假设，通过后续实验进行了进一步考察。

表3 BC-SPIs中BC及其代谢产物在Caco2-HT29共培养细胞中的转运量Table 3 Cellular transport in Caco2-HT29 co-culture of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.4 消化前后BC-SPIs的黏液层渗透性及转运模式的考察结果

2.3.4.1 消化前后BC-SPIs的黏液层渗透性

为进一步探究消化改善BC-SPIs转运吸收特性的机制，分别对消化前后BC-SPIs的黏液层渗透性和跨膜转运模式进行考察。尽管BC-SPIs在消化后具有更大的粒径和更多的负电荷，但能够穿透细胞模型黏液层的整体VA当量较消化前有所增加（表4）。负电荷数量的增加和尺寸的增大会阻碍颗粒在黏液层中的迁移，而胆盐吸附则能增强颗粒在黏液层的渗透性，综合来看，表面胆盐的修饰作用要大于表面电荷和粒径变化带来的影响。结合表3和表4中所述BC及其代谢产物的胞内积累量和转运量，发现消化后的BC-SPIs跨越黏液层屏障的能力提高了0.48 倍。

表4 消化前后BC-SPIs的HT29黏液层渗透性Table 4 Permeability through HT29 mucus layer of BC-SPIs before and after digestion

2.3.4.2 消化前后BC-SPIs在Caco2细胞中的吸收、转运效率

从表5可看出，消化后的BC-SPIs除了黏液层渗透性得到了提高，其跨膜吸收量也有所提升。与Caco2/HT29共培养模型对比来看，Caco2细胞中所积累的BC及其代谢产物含量更高，这可能是由于共培养模型中的黏液层会阻碍了BC-SPIs与Caco2细胞的接触，导致BC-SPIs穿透黏膜层进入到小肠上皮细胞中效率变慢，积累量降低。

表5 消化前后BC-SPIs中BC及其代谢产物在Caco2细胞中的积累量Table 5 Cellular accumulation in Caco2 cells of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

如表6所示，与胞内吸收的结果类似，相比Caco2/HT29共培养模型，Caco2模型中所转运的BC及其代谢产物含量更多，代谢规律趋势与共培养模型类似。结合表5和表6中所述胞内积累和转运BC含量，发现消化后的BC-SPIs跨膜转运量提高了0.56 倍。

表6 消化前后BC-SPIs中BC及其代谢产物在Caco2细胞中的转运量Table 6 Cellular transport in Caco2 cells of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.4.3 消化前后BC-SPIs的单层细胞膜转运模式

目前的观点认为大部分BC-SPIs是通过内吞作用进入到细胞内部。内吞作用途径包括网格蛋白依赖的内吞作用、小窝蛋白依赖的内吞作用、非网格蛋白和小窝蛋白依赖的内吞作用、巨胞饮作用、小窝/脂阀依赖的内吞作用，分别可以通过使用内吞作用抑制剂（氯丙嗪、吲哚美辛、槲皮素、β-环糊精和阿米洛利排除特定的内吞作用，阐释转运BC-SPIs的内吞作用机制[5]。

如图11所示，当用不同的抑制剂处理细胞时，细胞对BC-SPIs的相对吸收率有不同程度的降低。与37 ℃正常温度的转运相比，细胞转运在4 ℃时受到明显的抑制。说明BC-SPIs的转运方式主要是需要能量的主动内吞作用。使用氯丙嗪和吲哚美辛处理细胞时，BC-SPIs的相对吸收率减少50%左右，说明网格蛋白依赖的内吞作用和小窝蛋白依赖的内吞作用对BC-SPIs的转运起重要作用。

而当BC-SPIs经过消化后转运时，不仅是吲哚美辛和氯丙嗪能够抑制其内吞作用，阿米洛利也显著影响了颗粒的转运，说明消化后颗粒的转运模式主要为网格蛋白依赖的内吞作用、小窝蛋白依赖的内吞作用和巨胞饮作用。

为了进一步明确消化后颗粒转运模式发生变化的原因，对可能的消化条件影响因素进行了验证。如图12所示，在4 种消化模式中，仅添加胆盐促进了小窝蛋白和网格蛋白依赖的内吞作用，并不会引发巨胞饮；而仅添加胰蛋白酶则会促进巨饱饮作用。产生这种差异的原因，可能在于在不同消化条件影响下，BC-SPIs结构产生了不同程度的变化。据报道，当BC-SPIs的尺寸为120～150 nm时，颗粒主要通过网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞，在200 nm以下的粒子主要是以小窝蛋白依赖的内吞作用进行转运[28]。而巨胞饮则可以将亚微米和更大尺寸的大颗粒内化在细胞中[29]。带负电荷的BC-SPIs更有可能利用小窝蛋白依赖的内吞作用[29]。在消化前，由于BC-SPIs的粒径（＜200 nm）以及颗粒带负电的原因，导致细胞转运纳米颗粒的主要方式是网格蛋白以及小窝蛋白依赖的内吞作用。经过消化后，由于胰蛋白酶的作用，颗粒在消化过程中发生絮凝，导致颗粒的粒径增加，从而促进巨饱饮作用的产生，而胆盐与颗粒的相互结合导致颗粒带有更多的负电，影响了小窝蛋白依赖的内吞作用。而在消化前后溶液中都存在200 nm以下的颗粒，因此对网格蛋白依赖的内吞作用影响不大。

图12 消化条件因素对 BC-SPIs网格蛋白依赖内吞作用（A）、小窝蛋白依赖内吞作用（B）和巨胞饮（C）的影响Fig. 12 Effects of digestion conditions on clathrin-mediated endocytosis (A),caveolin-mediated endocytosis (B), and macropinocytosis (C) of BC-SPIs

3 结 论

BC-SPIs经消化后界面蛋白水解、颗粒尺寸增加，且一定量的胆盐分子吸附于表面。消化后的颗粒在小肠上皮细胞膜的吸收转运量较初始颗粒有所增加，一方面是因为表面吸附的胆盐促进了消化后的颗粒在黏液层的渗透，提高了小肠上皮细胞膜的跨膜转运量；另一方面则是因为颗粒结构变化带来的转运途径的增加，在小窝蛋白和网格蛋白依赖的内吞作用基础上，增加了巨胞饮转运途径，减少了黏液层和跨膜转运双重吸收屏障的限制，促进了细胞对BC的吸收和利用。