紫薯花青素通过调节p53-p21Waf1/Cip1信号通路对辐射致造血干/祖细胞衰老的保护作用

陈彩云，王若宇，张家乐，张怡明，石塔拉，宓 伟,*

（1.滨州医学院公共卫生与管理学院，山东 烟台 264003；2.滨州医学院第二临床医学院，山东 烟台 264003）

据第7次全国人口普查结果显示，截至2021年5月我国60 岁以上的老年人口已达到2.64 亿，占总人口比重的18.7%，人口老龄化进一步加剧，探寻延缓衰老的天然植物药已成为研究者关注的热点[1]。造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）是更新能力强并能分化为各系造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）的原始造血细胞，HSC衰老与机体衰老以及老年人多种慢性病密切相关[2-4]。在电离辐射等应激状态下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在细胞内产生量增多，可能通过激活p53-p21Waf1/Cip1通路、Wnt/β-catenin通路、p38-AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路、p16-Rb通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路等多条信号通路，导致HSC的DNA损伤，阻碍正常细胞周期而使细胞阻滞于G1期，导致细胞衰老，但具体的分子机制仍不明确[5-9]。

紫薯富含锌、硒等微量元素和花青素类成分[10]。紫薯花青素（Solanum tuberosumanthocyanin，STA）是一种具有C6-C3-C6结构的类黄酮化合物，可以作为原料生产食品的着色剂，亦是一种强效抗氧化剂，具有抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血脂等多种药用功能[11-14]。STA与其他来源花青素相比，耐热性好、稳定性强、机体利用率高，在食品、药品、保健品和化妆品等领域更具有开发价值。研究显示，辐射造成HSC的DNA损伤后，共济失调毛细血管扩张突变（ataxia telangiectasia mutated，ATM）和ATM与Rad3相关（ATM and Rad3 related，ATR）激酶会被激活并聚集于DNA损伤部位，使H2A组蛋白变异体（H2AX）磷酸化从而激活p53，活化的p53通过抑制p21的表达、下调细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2），阻滞细胞周期在G1期，造成HSC衰老，导致机体细胞衰老加速[15-16]。本实验旨在探讨STA对辐射致造血干/祖细胞衰老保护作用的分子机制，为探寻延缓HSC衰老和机体衰老的天然植物药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

清洁级C57BL/6小鼠，雄性，6～8 周龄，体质量24～28 g，由滨州医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2020-0012。在无特定病原体的条件下常规喂养小鼠，适应性喂养1 周后用于实验。本研究得到滨州医学院动物伦理学委员会的批准，批准号为SCK（鲁）2021-0018。

STA（聚合度≥99%） 杭州绿盛生物技术有限公司；伊思柯夫改良培基（Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM）、马血清（horse serum，HS）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 武汉普诺赛生命科技有限公司；TRIzol、SYBR Green I染料 日本TaKaRa公司；实时定量聚合酶链式反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）试剂、PCR引物美国Invitrogen公司；Anti-Sca-1＋Micro Bead Kit美国Miltenyi公司；衰老相关β-半乳糖苷酶（senescenceassociatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）染色试剂盒美国Cell Signaling公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）、重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO） 上海普欣生物技术有限公司；Ficoll分离液、蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、增强化学发光（enhanced chemiluminescene，ECL）试剂盒 北京普利莱基因科技有限公司；MiniMACS磁珠分选系统 德国Miltenyi Biotech公司；小鼠干细胞集落形成混合培养基 美国Stem Cell公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、p53、p21Waf1/Cip1一抗、二抗IgG 英国Abcam公司；总RNA提取试剂盒、SYBR green试剂盒 上海翌圣生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

qPCR仪 澳大利亚Corbett公司；HB-7021血细胞分析仪 日本优瑞特公司；FACSCalibur流式细胞仪美国Becton Dickinson公司；凝胶成像分析系统 美国Alpha Innotech公司；倒置显微镜、BX-26荧光显微镜日本Olympus公司；直线加速器 英国飞利浦公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组和给药

C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、STA治疗组和STA预防组，每组30 只。模型组和STA治疗组小鼠用直线加速器全身一次性照射X射线，照射剂量57.28 cGy/min，照射总剂量6.5 Gy，距离为75 cm，照射面积为20 cm×20 cm[17]。STA治疗组照射后皮内注射STA 60 mg/（kgmb·d），连续给药7 d，模型组于照射后皮内注射等剂量生理盐水连续7 d。STA预防组于照射前皮内注射STA 60 mg/（kgmb·d），连续给药7 d，照射后继续利用STA等剂量皮内注射7 d，对照组处理同模型组，但不进行照射。

1.3.2 血液指标测定

给药结束后，各组小鼠取眼球血，用血细胞分析仪检测外周血中红细胞（red blood cell，RBC）、白细胞（white blood cell，WBC）和血小板（platelet，PLT）的数量。

1.3.3 SA-β-Gal染色实验

参照免疫磁性分选法[18]分离纯化各组小鼠Sca-1＋HSC/HPC，按照SA-β-Gal染色试剂盒说明书对各组小鼠Sca-1＋HSC/HPC进行染色，倒置显微镜下选择6 个视野，以观察400 个细胞为标准，计算阳性细胞百分率。

1.3.4 造血干/祖细胞混合集落数的检测

收集各组小鼠Sca-1＋HSC/HPC，依次加入1×10－4mol/L的2-巯基乙醇，2.7 g/100 mL甲基纤维素，HS、rhGM-CSF、rhEPO各5 mL，共2 mL，充分混匀后接种于96 孔板，在37 ℃、5% CO2的培养箱培养7 d，显微镜下放大200 倍观察造血干/祖细胞混合集落（colony forming unit-mixture，CFU-Mix）数，并以此评价各组细胞形成造血祖细胞集落能力[19]。

1.3.5 流式细胞术分析细胞周期

用体积分数70%冰乙醇溶液将收集的各组小鼠Sca-1＋HSC/HPC固定过夜，加入100 μL 60 U/mg牛胰核糖核酸酶溶液，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶染色30 min，流式细胞术检测各组细胞周期情况。

1.3.6 qPCR检测p53和p21Waf1/Cip1mRNA的表达量

收集各组Sca-1＋HSC/HPC，用TRIzol裂解液提取各组细胞总RNA，将其反转录为cDNA，反转录条件：42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。以反转录的cDNA为模板，扩增p53和p21Waf1/Cip1，以GAPDH为内参。扩增条件：94 ℃ 4 min、94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 个循环。通过熔解曲线分析产物的特异性，Quantity One软件分析基因条带光密度值并计算与内参的比值，以此作为基因表达量。自行设计的引物序列见表1。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.7 Western blot检测p53和p21Waf1/Cip1蛋白的表达

收集各组Sca-1＋HSC/HPC，用BCA法检测RIPA裂解液提取的蛋白浓度。在提取蛋白液中加入质量分数6%蛋白上样缓冲液，沸水变性5 min，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后湿移至聚偏二氟乙烯膜上，37 ℃封闭2 h，依次加入p53和p21Waf1/Cip1一抗4 ℃过夜，漂洗后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2 h，滴加ECL发光试剂进行检测，凝胶成像曝光后观察比较。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 23.0软件进行数据处理与分析，结果用平均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间采用单因素方差分析，有统计学意义的再采用两两比较的q检验，检验水平为α＝0.05。

2 结果与分析

2.1 STA对辐射小鼠外周血的影响

由表2可知，模型组小鼠于外周血RBC、WBC、PLT数均极显著低于对照组（P＜0.01）；与模型组相比，STA治疗组和预防组小鼠外周血RBC、WBC、PLT数显著或极显著增加（P＜0.05，P＜0.01），且STA预防组小鼠外周血各指标恢复好于效果STA治疗组，表现为以上指标显著高于SAT治疗组（P＜0.05），且更接近对照组。

表2 STA对辐射小鼠外周血象的影响（n＝6）Table 2 Effect of STA on peripheral hemogram of radiated mice (n = 6)

2.2 各组小鼠Sca-1＋ HSC/HPC SA-β-Gal染色阳性率结果

由图1可知，SA-β-Gal染色液染色后，小鼠Sca-1＋HSC/HPC的衰老细胞胞质内见蓝色颗粒则呈阳性，细胞呈空泡状为阴性。模型组细胞阳性率极显著高于对照组（P＜0.01），与模型组比较，STA预防组细胞阳性率显著降低（P＜0.05），且STA预防组细胞阳性率低于STA治疗组（P＜0.05）。

图1 各组小鼠Sca-1＋ HSC/HPC SA-β-Gal染色结果（n＝6）Fig. 1 SA-β-Gal staining of Sca-1+ HSC/HPC in mice from each group (n = 6)

2.3 STA对小鼠Sca-1＋ HSC/HPC形成CFU-Mix能力的影响

由图2可知，模型组Sca-1＋HSC/HPC形成的CFU-Mix数与对照组相比极显著减少（P＜0.01）。与模型组比较，STA治疗组和STA预防组形成的CFU-Mix数分别显著和极显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且STA预防组形成的CFU-Mix数显著高于STA治疗组（P＜0.05）。

图2 各组小鼠Sca-1＋ HSC/HPC形成的CFU-Mix数（n＝6）Fig. 2 Number of CFU-Mix of Sca-1+ HSC/HPC in mice from each group (n = 6)

2.4 STA对小鼠Sca-1＋ HSC/HPC的细胞周期分布的影响

由表3可知，与对照组相比，模型组G0/G1期细胞比例极显著增高，G2/M和S期比例极显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，STA治疗组和STA预防组G0/G1期细胞比例分别显著和极显著降低（P＜0.05，P＜0.01），G2/M和S期比例分别显著和极显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且STA预防组与STA治疗组相比各细胞周期分布亦有显著差异（P＜0.05）。

表3 STA对Sca-1＋ HSC/HPC细胞周期分布的影响（n＝6）Table 3 Effect of STA on cell cycle distribution of Sca-1+ HSC/HPC (n = 6)%

2.5 STA对小鼠Sca-1＋ HSC/HPC的p53和p21Waf1/Cip1mRNA表达的影响

由图3可知，模型组p53和p21Waf1/Cip1mRNA的相对表达量极显著高于对照组（P＜0.01），与模型组相比，STA治疗组和STA预防组的p53和p21Waf1/Cip1mRNA的相对表达量分别显著和极显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且STA预防组显著低于STA治疗组（P＜0.05）。

图3 STA对小鼠Sca-1＋ HSC/HPC p53、p21Waf1/Cip1 mRNA表达的影响（n＝6）Fig. 3 Effect of STA on mRNA expression of p53 and p21Waf1/Cip1 in Sca-1+ HSC/HPC in mice (n = 6)

2.6 STA对小鼠Sca-1＋ HSC/HPC的p53和p21Waf1/Cip1蛋白表达的影响

由图4可知，模型组p53和p21Waf1/Cip1蛋白的相对表达量极显著高于对照组（P＜0.01），与模型组相比，STA治疗组和STA预防组p53和p21Waf1/Cip1蛋白的相对表达量分别显著和极显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且STA预防组显著低于STA治疗组（P＜0.05）。

3 讨 论

在临床放射治疗的过程中辐射损伤可导致机体组织和器官损伤，尤其对造血干细胞的破坏最为严重，可抑制HSC的增殖并诱导机体衰老速度加快[20]。寻找通过经典信号通路抑制HSC衰老的天然植物靶向药从而延缓细胞衰老和机体衰老具有非常重要的临床意义[21-23]。本研究采用辐射导致小鼠Sca-1＋HSC/HPC衰老模型来研究STA的体外抗衰老作用，结果表明STA对Sca-1＋HSC/HPC的衰老有明显的治疗和预防效果，并且STA预防Sca-1＋HSC/HPC衰老的效果更明显。

影响细胞衰老的环境因素通过基因调控使细胞周期停滞是细胞衰老的机制之一，现代药理研究发现，STA是紫薯具有延缓衰老功能的植物活性成分，能延长老年大鼠生存时间[24-27]。本实验研究表明，模型组小鼠于辐照后外周血RBC、WBC、PLT数均极显著降低（P＜0.01），辐射后小鼠的造血能力明显下降，利用SA-β-Gal试剂盒染色后小鼠Sca-1＋HSC/HPC中的衰老细胞胞质内见蓝色颗粒，衰老细胞数极显著增多（P＜0.01），衰老导致HSC/HPC分化潜能受损，因此形成的CFU-Mix数极显著下降（P＜0.01）。由于辐射导致衰老的HSC/HPC基因合成能力下降使其细胞分化停滞在G0/G1期不能进入S期，而STA可提升辐射后小鼠Sca-1＋HSC/HPC分化增殖能力，降低辐射导致的HSC/HPC衰老作用。在细胞衰老的调控网络中，p53-p21Waf1/Cip1分子信号通路是HSC衰老的关键路径，p53基因是一种细胞生长周期中的负调控因子，可使细胞周期停滞在G1期而不进入S期[28-32]。HSC/HPC受到辐射损伤后，其ROS产生量增加，模型组p53和p21Waf1/Cip1mRNA和蛋白的相对表达量极显著高于对照组（P＜0.01），说明辐射损伤可通过上调p53-p21Waf1/Cip1信号通路导致造血干/祖细胞衰老加速。STA除了发挥抗氧化作用，还会抑制ATR激酶聚集于DNA的损伤部位，避免损伤部位的组蛋白变异体磷酸化，从而抑制p53和p21Waf1/Cip1的表达，促进Sca-1＋HSC/HPC细胞周期由G1期进入S期，保护造血干细胞的正常生理功能。

本实验利用辐照X射线制备小鼠衰老细胞模型，通过血液指标检测、SA-β-Gal染色、CFU-Mix检测、流式细胞术分析细胞周期、qPCR检测mRNA表达和Western blot检测蛋白表达，进一步分析STA治疗和预防辐射致造血干/祖细胞衰老的保护机制，结果表明STA可以通过下调p53-p21Waf1/Cip1信号通路保护受到辐射的HSC/HPC，且预防效果优于治疗效果，本研究可为利用食品活性成分干预HSC衰老提供一定的思路。