猕猴桃软化过程中细胞壁修饰酶活性与果胶理化特性

古佩娴，刘声鹏，黄 超，陈 云，胡 勇，吴小勇，胡 坤,*，伍芳芳,*

（1.广东药科大学公共卫生学院，广东 广州 510220；2.广东药科大学食品科学学院，广东 中山 528458）

猕猴桃（Actinidiaspp.）又名奇异果，属于猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）。猕猴桃原产于中国，享有“水果之王”的美誉，是富含多种活性化合物的高营养水果，VC含量尤为显著。因其具有很高的营养价值、经济价值和医疗保健作用，而成为产业迅速发展的一种新兴水果。但猕猴桃是典型的呼吸跃变型水果，通常情况下其贮藏期和货架期短，不耐贮运，从而严重制约着猕猴桃的经济发展[1]。研究表明猕猴桃硬度的软化、营养物质的改变与细胞壁修饰酶、细胞壁多糖的结构变化紧密相关[2]。有学者指出，薄壁组织细胞壁的机械性能、相邻细胞之间黏附区域的强度和延伸性以及细胞膨胀程度是肉质果实硬度的主要决定因素[3]。

果胶是一种结构复杂的聚合物，自然存在于初生细胞壁和中片层，有助于增强细胞间的黏附力和细胞的机械强度，其复杂性、长度等与果实硬度紧密相关[4-5]。后熟水果在软化过程中会经历细胞壁的修饰，其中涉及果胶和部分半纤维素的广泛解聚、果胶的溶解和果胶侧链中性糖的损失[6]。常见的细胞壁修饰酶包括果胶酶如多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、果胶裂解酶（pectate lyases，PL）和糖苷水解酶如β-半乳糖苷酶（β-D-galaetosidase，β-Gal）等[7-10]。为了探索果实质地变化的内在原因，研究者们对不同种类水果细胞壁修饰酶的作用模式进行了广泛的研究，如冬枣[7]、杏[11]、番荔枝[12]、蓝莓[13]等。然而目前对猕猴桃果实在贮藏过程中果胶理化特性与细胞壁修饰酶的综合研究较少。因此，本实验以‘亚特’猕猴桃果实为研究对象，探究其软化过程的果胶结构变化与细胞壁修饰关键酶包括PG、PME、PL和β-Gal等的活力变化，分析猕猴桃后熟软化过程中的细胞壁变化机制。同时，对细胞壁果胶多糖组分进行分离，得到水溶性多糖（water soluble polysaccharide，WSP）、反式-1,2-环己烷二胺四乙酸（trans-1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid，CDTA）溶性多糖（CDTA-soluble polysaccharide，CSP）和Na2CO3溶性多糖（Na2CO3-soluble polysaccharide，NSP），并对其理化特性进行进一步研究，为果实软化的机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜‘亚特’猕猴桃（Actinidia deliciosa‘Yate’）采集自中国陕西省周至县，选择成熟度一致（可溶性固形物含量为（10.0±0.2）ºBrix）、大小均一的果实作为实验样品。

PL活性检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白质定量试剂盒 上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜、氯仿、甲醇、浓硫酸（均为分析纯）广东广试试剂科技有限公司；果胶（半乳糖醛酸质量分数大于74.0%）、溴化钾（色谱纯） 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TA-XT plus物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；UV-1800紫外分光光度计 日本岛津公司；Synergy H1多功能微孔版检测仪 美国Biotek仪器公司；Nicolet IS50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Nano-ZS激光粒度分析仪 英国Malvern仪器有限公司；1525高效凝胶渗透色谱仪（配备2414示差检测器） 美国Waters科技公司；SDT 650热分析仪 美国TA仪器公司；EVO-18扫描电子显微镜德国ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 猕猴桃样品的处理

将猕猴桃样品随机分成4 组，每组样品个数相同，分别贮存在（5±1）℃、80%相对湿度的冰箱中，以便果实进一步成熟软化。在每个取样日期（第0、5、10、15天）进行果实硬度测定，并收集猕猴桃无籽果肉用于细胞壁修饰酶活力、果胶成分的提取和相关指标的测定，将第0天的猕猴桃样品设为对照。

1.3.2 果实硬度测定

使用物性分析仪测定果实的硬度。为了保证硬度测定的准确性，在相同的环境条件下（温度、湿度、空气流速）将猕猴桃果实切半，在果实赤道部位90°垂直于地面方向测量2 次，取平均值。测试模式选择质构剖面分析（texture profile analysis，TPA），参数设置：探头P5；触发力5.0 g；测试前速率1.0 mm/s；测试速率5.00 mm/s；测试后速率5.00 mm/s；时间5 s。硬度单位为N。

1.3.3 细胞壁修饰酶活力测定

所有细胞壁修饰酶的提取与活力测定均在冰浴条件下进行。PL活力采用试剂盒测定。PG的活力参考Zhou Qian等[14]的方法测定，以1 mL酶液每小时催化果胶生成1 mg半乳糖醛酸表示一个单位酶活力（U），单位为U/mg。PME活力采用Saleem等[15]的方法测定，以每分钟引起反应体系在620 nm波长处吸光度变化1表示一个单位酶活力（U），单位为U/mg。β-Gal活力参考Yi Junjie等[9]的方法测定，以1 mL酶液每小时产生1 μmol/L对硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）表示一个酶活力单位（U）。以上酶活力单位均为U/mg。每次测定分别随机取4～8 个果实的无籽果肉混匀并设3 个重复。

1.3.4 猕猴桃果胶多糖的提取分离与理化特性研究

1.3.4.1 细胞壁成分的提取与分离

根据Cybulska[5]和Chen Yihui[16]等的方法，使用体积分数95%乙醇溶液、氯仿/甲醇（1∶1，V/V）混合物及体积分数80%丙酮溶液对果肉进行除杂，体积分数90%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）4 ℃浸提过夜，所得到的残渣干燥后分别用去离子水、20 mmol/L CDTA溶液（pH 6.5，含100 mmol/L NaAc）、50 mmol/L Na2CO3溶液浸泡振荡，并用4 倍体积的无水乙醇进行静置沉淀，分别得到WSP、CSP和NSP。冷冻干燥后置于干燥器中保存备用。

1.3.4.2 果胶含量、蛋白质含量、酯化度和甲氧基质量分数的测定

参考Gerschenson等[17]的方法，采用硫酸-咔唑法测定样品中的果胶含量。以去离子水为空白对照，以半乳糖醛酸绘制标准曲线，WSP、CSP和NSP中果胶的含量以每克冻干样品中含有的半乳糖醛酸质量表示，单位为mg/g。蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白绘制标准曲线，在595 nm波长处测定吸光度并按Bradford[18]所述方法计算蛋白质含量。酯化度与甲氧基质量分数采用化学滴定法测定[19]。

1.3.4.3 傅里叶变换红外光谱、粒径分布与Zeta电位测定

取少量冻干的多糖样品与适量干燥的KBr混合充分研磨后压成薄片，使用傅里叶变换红外光谱仪进行红外扫描，光谱扫描范围为400～4 000 cm－1。使用Nano-ZS激光粒度分析仪在25 ℃下测定多糖溶液（2 mg/mL）的Zeta电位和粒径分布。

1.3.4.4 分子质量测定

参考Ren Yuanyuan等[12]的方法采用高效凝胶渗透色谱法测定样品的分子质量。将不同分子质量的葡聚糖标准品（5.2～668.0 kDa）和冻干的多糖样品用0.02 mol/L KH2PO4溶液溶解，分别配制成2 mg/mL的溶液，过0.22 μm的滤膜后即可上机检测。上样量为20 μL，柱温固定在35 ℃，流动相为0.02 mol/L KH2PO4缓冲液，流速为0.6 μL/min。色谱柱为TSK G-5000 PWXL柱（300 mm×7.8 mm）和TSK-GEL-G-3000柱（300 mm×7.8 mm）串联。

1.3.4.5 热稳定性分析

使用热分析仪对多糖样品进行热重（thermogravimetric，TG）分析。每个多糖样品（3～7 mg）在流动的氮气环境中以25 ℃/min的速率从室温加热到500 ℃。将所得数据绘制成TG和微分热重（derivative thermogravimetric，DTG）分析曲线。

1.3.4.6 扫描电子显微镜观察

采用扫描电子显微镜观察猕猴桃多糖WSP、CSP和NSP的形貌特征。取适量冷冻干燥后的样品用导电胶固定在样品台上，在其表面喷涂3～6 nm厚金层，在加速电压10 kV、放大500 倍的条件下观察样品。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2010软件进行数据统计处理，结果以平均值±标准差表示；采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和相关性分析，并使用Origin 2021软件绘图。设置差异显著性的检验水平为α＝0.05。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃果实贮藏过程中的硬度变化

如图1所示，在实验条件下，猕猴桃果实的硬度表现为先快速下降后缓慢下降的经典两段式软化历程，与大多数猕猴桃果实软化模型[20]相同。在贮藏的前5 d内硬度下降幅度最大（85.19%），从24.98 N迅速降至3.70 N。此后果实由快速软化阶段进入缓慢软化阶段。15 d时果实的硬度小于1 N，猕猴桃达到完全软化。

图1 贮藏期间猕猴桃果实的硬度变化Fig. 1 Changes in the hardness of kiwifruits during storage

2.2 猕猴桃果实贮藏过程中的细胞壁修饰酶活力变化

如图2A～C所示，PG、PME、PL活力均表现出先上升后降低的变化趋势，15 d时PG和PME活力均显著低于0 d时的酶活力，这与贾德翠等[21]的研究结果一致。PG活力在贮藏10 d内持续上升，第10天达到最大值（670.76 U/mg），贮藏15 d时急剧下降，仅为127.09 U/mg。贮藏5 d时PME活力达到最大值（9.17 U/mg），此后下降至低于1 U/mg。PME活力变化特征与Yi Junjie[9]和Fan Xinguang[11]等的研究结果一致。贮藏的前5 d内，PG和PME活力增长幅度最大，与此时猕猴桃果实硬度的快速下降相对应。有研究表明，在PG和PME两种酶的共同作用下，β-Gal从鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamnogalacturonan I，RG-I）的侧链和果胶脱氧基团中流失，与早期果实的快速成熟密切相关[22]，Cárdenas-Péreza等[23]的研究表明，在5 ℃、相对湿度26%条件下，芒果成熟的初始阶段，PME的活性增强并产生大量果胶酸，从而为PG发挥作用提供底物，造成果实硬度的损失。PL活力高峰出现在贮藏的第5天，达3.41 U/mg。

图2 贮藏期间猕猴桃果实的PG（A）、PME（B）、PL（C）和β-Gal（D）活力Fig. 2 PG (A), PME (B), PL (C) and β-Gal (D) activities in kiwifruits during storage

β-Gal通过作用于细胞壁多糖侧链中的非还原末端β-D-半乳糖残基，促进细胞壁结构的解体[24]。如图2D所示，在整个后熟过程中，猕猴桃果实β-Gal的活力持续上升，至第15天时达到峰值（12.58 U/mg）。

2.3 贮藏期间猕猴桃果实细胞壁多糖理化特性分析

2.3.1 果胶含量、蛋白质含量、酯化度和甲氧化程度分析

由表1可知，在整个贮藏期间猕猴桃无籽果肉中WSP的果胶含量呈现出持续上升的趋势，与Wang Hui等[25]的研究结果一致。贮藏至15 d时WSP果胶含量达到9.42 mg/g，相比于贮藏0 d增长了334.10%（P＜0.05）。在贮藏的10～15 d，WSP果胶含量的增长幅度最大。结合图2结果，10 d时是PG活力最高的时间，提示PG活力对细胞壁成分间的转化起关键作用。与以往研究中CSP果胶含量持续降低[12,25]表现不同的是，本研究中贮藏10 d时的CSP果胶含量骤然增加，这可能与此时PME活力被抑制，CSP与Ca2＋交联形成“蛋盒”结构有一定的关系[26]。在果实成熟后期，CSP和NSP果胶含量的下降削弱了细胞壁的强度，从而加剧了细胞壁的变薄和致密结构的松动[27]。

表1 贮藏期间WSP、CSP和NSP的果胶含量、蛋白质含量、酯化度和甲氧基质量分数Table 1 Pectin contents, protein contents, esterification degrees and methoxy contents of WSP, CSP and NSP during storage

由表1可知，NSP的蛋白质含量在4 个贮藏时间点均高于WSP和CSP，NSP中蛋白质含量在贮藏10 d时最高，达到2.01 mg/g。酯化度和甲氧基质量分数测定结果表明猕猴桃中提取得到的WSP、CSP和NSP均为高酯果胶（high-methoxy pectin，HMP），酯化度均大于50%，且甲氧基质量分数均大于7%。甲氧基质量分数也是反应果胶酯化度的指标[28]。CSP和NSP的酯化程度于贮藏10 d时降低，这可能与PME能够催化果胶半乳糖醛酸残基，使果胶部分脱去甲氧基，催化果胶酯酸转化为果胶酸，生成适合PG作用的底物有关[29]。

2.3.2 傅里叶变换红外光谱分析

图3中，在3 420～3 439 cm－1处呈现的下降宽频带吸收峰提示存在广泛的分子内O—H键伸缩振动；在2 923～2 833 cm－1处观察到的较小吸收峰可能是糖链中甲基和甲酯中甲基的C—H键伸缩与弯曲振动引起的；1 728～1 752 cm－1处的伸缩振动由乙酰基或醛基的C＝O共振所引起；1 595～1 630 cm－1处和1 408～1 425 cm－1处的吸收峰分别归属于羧基（—COOH）的非对称共振和对称共振峰，其中1 728～1 752、1 595～1 630 cm－1与1 408～1 425 cm－1处的特征吸收峰共同构成了果胶中糖醛酸的特征结构[30]。在1 250～1 267 cm－1和1 105～1 109 cm－1区域的吸收峰分别是由C—O、C—H或C—C伸缩共振引起，WSP和CSP在1 100 cm－1附近的吸收峰通常与葡萄糖残基中C—O—C和C＝O的伸缩振动有关；在910 cm－1附近的特征吸收峰归属为β-D-吡喃葡萄糖峰。NSP于848～907 cm－1区间存在α-D-吡喃葡萄糖环的特征吸收峰。综合来看，0～15 d的贮藏过程中，CSP和NSP的O—H键伸缩振动峰发生蓝移，分别从3 397.5 cm－1和3 395.6 cm－1移位至3 432.7 cm－1和3 465.0 cm－1，这可能与样品中Ca2＋与果胶基质之间的氢键变化有关[31]。与贮藏前期（0 d）相比，贮藏后期（15 d）WSP中离子羧基（—COO—）的非对称伸缩振动峰发生了蓝移（从1 596.3 cm－1移位至1 630.5 cm－1）。CSP的C＝O键振动峰与烷基中C—H变形振动吸收峰在贮藏过程中（0～15 d）发生红移，分别从1 647.9 cm－1和1 456.5 cm－1移位至1 598.7 cm－1和1 412.1 cm－1。贮藏0 d时，CSP中存在865.9 cm－1处的伸缩共振吸收峰，提示此时的CSP含有α-糖苷键，贮藏5 d后CSP中α-糖苷键的振动峰消失，这种变化可能与葡萄糖异构化有关[32]。

2.3.3 Zeta电位与粒径分析

多糖的Zeta电位反映了多糖溶液的稳定性，一般而言， Zeta电位的绝对值越高多糖越稳定[33]。如图4A1～C1所示，WSP的Zeta电位绝对值小于15 mV，贮藏期间Zeta电位变化不显著。与其他两种多糖相比，CSP具有最大的负电荷量，贮藏至5 d时Zeta电位绝对值升高至大于30 mV，比贮藏0 d时的Zeta电位绝对值升高了63.31%，此后Zeta电位不再发生显著变化，表明贮藏5 d后CSP具有更高的分子间斥力，相对稳定。NSP的Zeta电位绝对值先增大后减小，贮藏15 d时NSP的Zeta电位绝对值为14.32 mV，与贮藏中期相比稳定性下降。

图4A2～C2所示，贮藏0 d时WSP的平均粒径为923 nm，贮藏5 d后平均粒径增大，在贮藏10 d 后平均粒径稳定在1 300 nm左右。CSP粒径分布图存在两个信号峰，贮藏0 d两个峰存在部分重叠，主峰位于1 473 nm处，次峰位于255 nm处。贮藏5 d后两个信号峰逐渐分离，至贮藏15 d时出现粒径约为59 nm的成分。NSP的粒径分布变化与CSP相似，贮藏0 d时NSP的两个主峰位于59～825 nm内，存在部分重叠；另外，在5 560 nm附近出现了一组弱信号峰，可能是样品中存在的较大原纤维或团块所引起。贮藏5 d后NSP信号峰逐渐分裂，15 d时出现38 nm左右的小粒径成分。

2.3.4 分子质量分析

多糖的理化、功能和生物学特性与其分子质量密切相关[33]。如表2所示，WSP的重均分子质量（mw）均在贮藏过程中呈逐渐增大趋势，0 d时主要分布于0.93 kDa，其次位于7.81×102kDa；贮藏5 d时mw分布在1.09～73.2 kDa范围内，多分散性系数（polydispersity index，PDI）接近1，提示此时WSP分子质量分布均匀，样品均一性较好[28]。贮藏10 d后WSP的mw分布范围逐渐增加，至15 d时主要出现5.26×102kDa的成分，PDI比贮藏0 d时增大。CSP在贮藏0 d时分子质量分布不均匀，其mw在0.73～1.09×103kDa范围内均有分布；贮藏5 d后分布范围稍有变窄，15 d时主要分布在5.47×102kDa处。综合来看，CSP在贮藏0 d时mw较大，贮藏5 d开始CSP的mw先减小后增加。NSP的mw在贮藏开始时主要分布于0.89 kDa处，贮藏15 d时NSP的分子质量分布于0.17～84.60 kDa范围内，此时样品的PDI接近1，分子质量分布均匀。从NSP的分子质量分布来看，贮藏5 d后NSP主要成分的mw有逐渐减小的趋势，贮藏至15 d时长链成分消失，分子质量分布较均匀。结合β-Gal活力分析结果，NSP分子长度的缩短可能与侧链中糖苷键的断裂有关[5]。

表2 贮藏期间WSP、CSP和NSP的分子质量Table 2 Molecular masses of WSP, CSP and NSP during storage

2.3.5 热稳定性分析

热稳定性是多糖的重要化学性质之一[34]。如表3所示，在室温至500 ℃的升温过程中，WSP和NSP主要经历了2 个分解阶段，而CSP经历了3 个分解阶段。WSP降解的阶段I发生在25.00～162.34 ℃范围内，质量损失成分包括填充在果胶链之间的结合水和挥发性化合物等。阶段I引起的质量损失随着贮藏时间的延长逐渐增加，提示贮藏时间越长，键合在WSP糖链上的水越多。阶段II发生在151.58～499.24 ℃范围内，此时果胶的半乳糖醛酸链发生热降解释放出二氧化碳、一氧化碳、水和脂肪族化合物[35]。贮藏10 d时WSP阶段II的结束温度最高，为499.24 ℃，可能与此时WSP的分子质量最大有关。在阶段II，WSP的质量损失率随着贮藏时间的延长逐渐减少，降解结束后的残余量呈增加趋势，提示贮藏时间越久，猕猴桃WSP糖链的热稳定性越好。CSP的热降解阶段I发生在29.31～179.99 ℃，此阶段质量损失率随贮藏时间延长逐渐增加，贮藏15 d时质量损失率最大，是贮藏0 d时的近2 倍；阶段II发生在168.43～363.19 ℃，质量损失率随贮藏时间延长先升高后降低再升高，贮藏15 d时的质量损失率最大，为30.29%。CSP独有的阶段III降解发生在344.63～498.30 ℃，此阶段CSP的损失主要为糖链上的芳香碳残留物[36]，质量损失率随贮藏时间延长呈减少趋势。NSP的热降解阶段I发生在30.11～178.70 ℃；阶段II发生在157.02～498.37 ℃，贮藏5 d时的NSP在整个贮藏过程中质量损失率最少，降解结束温度最高，残余量最多，提示此时的NSP热稳定性最好。本研究中‘亚特’猕猴桃中WSP、CSP和NSP的热分解过程与其他品种猕猴桃[37]相一致，其中，WSP在贮藏15 d时热稳定性最好，CSP和NSP在贮藏5 d时热稳定性相对于其他时期较好。

表3 贮藏期间WSP、CSP和NSP的热重分析结果Table 3 Thermal gravimetric analysis of WSP, CSP and NSP during storage

2.3.6 果胶的微观形态观察

如图5所示，在放大500 倍的视野下，WSP表现为不规则的片状结构，表面相对光滑平整、层次清晰，表明多糖链发生聚集。贮藏0 d时WSP的微观结构较纤薄，贮藏5 d时片层增厚，面积较大，贮藏15 d时样品呈较小薄片状层叠排列，面积变小。贮藏0 d的CSP有大的空腔、扁平的膜状结构，为团簇状结构的混合，有较多交联缠绕形成，贮藏5 d时CSP变得松散，呈褶皱薄纱状，孔洞变小，边缘出现分支；此后CSP表现为更加光滑柔软，孔洞消失。贮藏期间NSP的微观形态呈表面毛糙的团簇状结构，贮藏5 d时NSP的不规则粗糙团块结构排列更加紧凑，贮藏10 d时有边缘粗糙的片状结构出现，排列较松散，15 d时块状结构崩塌，呈现出分散的颗粒团簇形态，碎屑增多，证实了部分NSP糖链在贮藏15 d时发生断裂和解离。

图5 贮藏期间 WSP、CSP和NSP的扫描电子显微镜图Fig. 5 SEM images of WSP, CSP and NSP during storage

2.4 相关性分析

如表4所示，猕猴桃果实硬度与贮藏时间之间呈极显著负相关（r＝－0.829）。PL活力与PG活力（r＝0.811）、PME活力（r＝0.903）均呈极显著正相关，提示这3 种果胶降解酶之间关系密切，共同导致了果实质地的软化。β-Gal活力与果实硬度之间呈极显著负相关（r＝－0.888），这与李圆圆等[38]的研究结果一致；同时，β-Gal活力与WSP果胶含量之间呈极显著正相关（r＝0.967），提示果胶侧链中的半乳糖损失导致了WSP的积累[24]。贮藏时间与WSP的重均分子质量呈极显著正相关（r＝0.921）。CSP的重均分子质量与贮藏时间呈显著负相关（r＝－0.626），与PG、PL和PME活力均呈显著或极显著相关（r分别为0.735、－0.818、－0.581），提示贮藏期间果胶酶对CSP的链长影响较大。

表4 猕猴桃贮藏期间各项指标相关分析Table 4 Correlation analysis among physicochemical indicators of kiwifruits during storage

3 结 论

在（5±1）℃、80%相对湿度的条件下猕猴桃果实硬度表现为两段式下降模式，果实发生软化。结合细胞壁修饰关键酶活力测定与多糖理化性质测定结果发现，β-Gal活力与WSP果胶含量之间呈极显著正相关关系；PG、PL和PME活力与CSP分子质量均呈显著或极显著负相关；另外，在贮藏5 d时，PME和PL活力均达到最大值，此时NSP的果胶含量最小，CSP的α-糖苷键振动峰消失且重均分子质量减小，扫描电子显微镜下观察其结构变得松散并出现边缘分支，宏观上表现为果肉硬度的下降幅度达到最大，猕猴桃经历快速软化。上述相关变化均提示，猕猴桃果肉中细胞壁修饰关键酶对于果肉中的细胞壁多糖组分及结构改变具有重要作用，最终导致了猕猴桃果实在贮藏过程中的质地软化。