壳聚糖-姜黄素光动力协同作用对圣女果食源性致病菌的灭活效果

蓝彩娟，陈洁怡，何雨薇，麻春阳，黄 蕊，Nima AZARAKHSH，Tanushree GUPTA，吴希阳,*

（1.暨南大学理工学院，广东 广州 510632；2.梅西大学Hopkirk研究所，新西兰 北帕默斯顿 4474）

食源性致病菌是导致食品污染和危害食品安全的主要原因之一。2018年中国疾控信息系统报告，食物中毒事件中63.1%的病例是由摄入食源性致病菌引起的[1]。其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）和单核细胞增生李斯特菌是世界卫生组织公示的四大食源性致病菌[2]。此外，产芽孢菌如蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）因具有高度抗逆性而被认为是食品灭菌中的一大挑战。

目前食品工业的主要杀菌方式分为热杀菌和非热杀菌。高温热处理容易导致热敏性食品如果蔬和生鲜肉品等感官特性和营养成分的变化。近年来，一项多应用于医学领域的杀菌技术——光动力处理（photodynamic treatment，PDT），因具有经济、便捷、无毒残留、无耐药性等优点，已经被开发应用于食品领域。PDT技术的关键要素是光敏剂、特定波长光源和氧气，3 个要素同时存在时可激发产生活性氧，进而攻击灭活细菌[3]。选择无毒无害的光敏剂和光源是PDT进入食品行业的关键。姜黄素（curcumin，Cur）是一种天然光敏剂、着色剂和调味品，提取于姜黄根茎，本身具有光敏、抗菌、抗炎、抗氧化等活性，可被400～500 nm光激发产活性氧[4]。

PDT在灭活细菌、真菌及其孢子等方面已被广泛报道，相比革兰氏阳性（G＋）菌，革兰氏阴性（G－）菌对PDT的敏感性较差[5]。该技术缺陷可以通过添加靶向分子或修饰光敏剂来解决。目前有研究报道，添加靶向分子如多黏菌素B、ε-聚赖氨酸、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等可协同增效PDT[6-9]。此外，也有学者将L-聚赖氨酸、多黏菌素B和壳聚糖（chitosan，Chi）与光敏剂共价偶联，通过修饰光敏剂以提高PDT灭菌效果[10-12]。然而，修饰光敏剂可能引发食品安全问题，因此，本实验的研究思路是在PDT技术中添加安全有效的靶向分子Chi。

Chi是一种生物可降解、无毒且具有广泛抗菌活性的阳离子聚合物[6]，已作为食品添加剂广泛用于制作可食涂膜并应用于果蔬保鲜。Chi涂层可以降低果蔬呼吸频率、保持水分、防止褐变和微生物污染，从而延长货架期[13]。圣女果是全球高消费率的即食水果之一，富含维生素和番茄红素等营养物质，但圣女果在种植过程中需施用粪肥和堆肥，且种植环境中存在的野生动物和爬行动物会提高致病菌如Salmonella的污染率[14]。另外，圣女果不耐贮藏，这给流通销售带来了巨大压力，因此圣女果的抗菌保藏问题亟待解决。

目前关于Chi-PDT的报道主要集中在Chi纳米复合材料的制备及其在癌症、皮肤病、牙科生物膜等医学领域的应用[15-17]。鲜有研究将PDT灭菌技术和Chi-Cur涂膜联合应用于水果抗菌和保藏。此外，果蔬携带的细菌种类丰富，但目前对致病菌的灭活研究主要集中在单一菌，鲜有对混合菌灭活的研究。因此，本研究探究Chi-Cur协同PDT对S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella单一菌和混合菌的灭活效果，以及Chi与PDT的协同机理及对圣女果抗菌效果和品质的影响，以期为食品安全生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

S. aureus（ATCC 6538）、B. cereus（CMCC 63303）、E. coli（ATCC 31350）、Salmonella（Salmonella Typhimurium，ATCC 14028）均保存于暨南大学理工学院食品科学与工程系。

‘千禧’圣女果购自广州某水果超市。

Cur（食品级，纯度＞95%） 陕西慈缘生物技术有限公司；Chi（75%～85%脱乙酰化） 美国Sigma-Aldrich公司；营养琼脂（nutrient agar，NA）、LB琼脂（LB agar，LA）、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、亚硫酸铋琼脂（bismuth sulfite agar，BS）广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉 德国Biofroxx公司；无水乙醇（分析纯） 天津市永大化学试剂有限公司；乙酸（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

发光二极管（light emitting diode，LED）光照设备（420 nm，69.97 mW/cm2）由暨南大学理工学院光电工程系和食品科学与工程系自主研发；DHP 120恒温培养箱 上海实验仪器厂有限公司；HNYC-2102智能恒温培养振荡器 天津欧诺仪器股份有限公司；X3FR高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；Infinite M200 PRO光栅型多功能微孔板检测仪 瑞士Tecan公司；LS-400均质器 上海比朗仪器制造有限公司；CS-820N色差仪 彩谱科技（浙江）有限公司；质构仪 美国博勒飞公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养

将冻存于－80 ℃冰箱的菌株取出，S. aureus、B. cereus和Salmonella划线于NA平板，E. coli划线于LA平板，于37 ℃倒置培养约12 h。挑取单菌落分别接种至相应液体培养基中，于恒温（37 ℃）培养箱振荡（120 r/min）培养至对数生长期。

1.3.2 Chi-Cur配制

用体积分数1%乙酸配制0.05%（质量分数，下同）Chi溶液。称取Cur溶于无水乙醇，配制成20 mmol/L Cur母液，0.22 μm无菌滤膜过滤，4 ℃避光保存，后续实验以无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）或0.05% Chi作为溶剂，配制所需浓度的Cur或Chi-Cur溶液。

1.3.3 不同质量分数Chi对致病菌的影响

取1 mL菌液分别与1 mL 0.05%、0.1%、0.5% Chi溶液混匀，孵育20 min，梯度稀释，吸取100 μL稀释液，向S. aureus、B. cereus和Salmonella菌液中倒入NA，向E. coli菌液中倒入LA并进行平板菌落计数，计数规则和菌落总数的计算方法参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.3.4 PDT灭活致病菌

为比较PDT和Chi-PDT的灭活效果，取1 mL菌液分别与1 mL 100 μmol/L Cur或0.05% Chi-100 μmol/L Cur混合于6 孔板，暗孵育20 min，用LED蓝光照射20 min（距离灯源10 cm）。为探究不同浓度Cur对Chi-PDT灭活效果的影响，取1 mL菌液分别与1 mL 0、5、15、25、50、100 μmol/L Cur（以0.05% Chi作为溶剂）混合，暗孵育20 min，用LED蓝光照射20 min。取1 mL菌液与0.05% Chi-15 μmol/L Cur混合，暗孵育20 min，用LED蓝光照射0、5、10、15、20 min，以探究不同光照时间对Chi-PDT灭活效果的影响。空白对照以等体积PBS代替，不做光照处理。处理结束后参照1.3.3节方法进行平板菌落计数。

1.3.5 PDT灭活混合致病菌

等体积混合S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella菌悬液，取1 mL上述混合菌液与1 mL 15 μmol/L Cur或0.05% Chi-15 μmol/L Cur混合，暗孵育20 min后光照20 min。空白对照组以等体积PBS代替，不做光照处理。处理结束后，用PCA平板参照1.3.3节方法进行平板菌落计数。

1.3.6 致病菌对Cur的吸收

参照Liang Zuxin等[8]的方法测定细菌对Cur的吸收量。用2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）稀释Cur，绘制标准曲线（Cur浓度为0～50 μmol/L）。将对数生长期的菌悬液和50 μmol/L Cur或0.05%Chi-50 μmol/L Cur等体积混合，暗孵育20 min，PBS洗涤两次，2% SDS溶液重悬，并于37 ℃避光孵育20 h。随后，5 500×g离心5 min，取上清液，用酶标仪测定其在425 nm激发波长、530 nm发射波长下的荧光强度。空白对照组以PBS替代Cur进行相同操作。

1.3.7 PDT应用于圣女果抗菌保鲜

圣女果用自来水清洗并去蒂，体积分数70%乙醇溶液消毒以除去其自带细菌，晾干。将无菌圣女果分成3 组，每组设置3 个平行，每个平行60 个果实，保藏期间用聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）盒子盛装并保存于25 ℃生化培养箱。将培养过夜的Salmonella用PBS稀释至1×107CFU/mL，将圣女果浸泡于菌悬液1 min后捞出晾干1 h。随后，将染菌果浸泡于100 μmol/L Cur或0.05% Chi-100 μmol/L Cur 1 min，捞出，于超净工作台干燥1 h，LED蓝光照射20 min。空白对照组用PBS替代并进行同样操作[18]。

1.3.7.1 微生物分析

从每个盒子随机选取2 颗圣女果置于无菌均质袋中，加入10 mL PBS，捏碎后用均质器拍打2 min。吸取均质液进行梯度稀释，吸取100 μL稀释液倒入BS琼脂，37 ℃倒置培养约24 h，对果实表面存活的Salmonella计数[18]。

1.3.7.2 色泽测定

从每个盒子随机选取3 颗圣女果，用色差仪监测其保藏期间的色泽变化。光源和角度为D65/10°，测量孔径为6 mm。测定果实中间部位，每个果实测定3 个不同的表面，记录明亮度（L*值）、红绿度（a*值）和黄蓝度（b*值）[18-19]。

1.3.7.3 质量损失率

每个监测日对圣女果称质量，质量损失率以当日果实质量相比初始质量减少的比例表示。

1.3.7.4 硬度测定

用质构仪测定圣女果硬度，选用直径为4 mm的探针，以1 mm/s的速率穿刺圣女果，刺入穿刺深度为10 mm[18]，每个果实穿刺两个不同的表面，结果用平均值表示。

1.4 数据统计与分析

数据结果以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据处理和作图，对实验数据进行单因素或双因素方差分析，采用Tukey多重比较检验进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 Chi的抑菌效果

据报道，Chi是具有抗菌性能的聚合物[6]。本研究结果显示Chi对4 种食源性致病菌均有不同程度的抑菌效果，并具有浓度依赖性。如图1所示，0.5% Chi分别使S. aureus和B. cereus的菌落总数减少了3.68（lg（CFU/mL））和6.37（lg（CFU/mL）），而使E. coli和Salmonella的菌落总数仅分别减少了1.25（lg（CFU/mL））和1.23（lg（CFU/mL）），即Chi对G＋菌的灭活效果明显优于G－菌，这一现象与Goy等[20]所报道的一致。富含阳离子的Chi在静电相互作用下可吸附到菌体表面，破坏其细胞结构和胞内大分子，从而导致细菌死亡。此外，Chi由乙酸配制而成，在酸性环境下，Chi会被广泛质子化，这会增强其与细菌表面阴离子基团中羧基和磷酸基的结合[21]。关于Chi对G＋菌和G－菌灭活效果的差异，Duan Chao等[22]报道，由于G-菌有外膜，Chi需要先通过取代外膜的Ca2＋和Mg2＋才能直接以静电相互作用吸附于细菌表面，导致细菌膜裂解，从而达到杀菌效果；而对于无外膜的G＋菌，Chi的多阳离子长链分子结构使其可以直接高效、大面积地吸附于细菌表面，因此灭活效果更佳。本研究探究Chi对PDT协同作用效果的实验中选用Chi的最低抑菌剂量（0.05%）。

图1 不同质量分数Chi对4 种致病菌的抑菌效果Fig. 1 Antibacterial efficacy of Chi at different concentrations against four pathogens

2.2 Chi-PDT对致病菌的灭活效果

2.2.1 PDT和Chi-PDT灭活效果比较

如图2所示，低剂量的Chi（0.05%）可分别使S. aureus和B. cereus的菌落总数减少3.05（lg（CFU/mL））和5.62（lg（CFU/mL）），而对E. coli和Salmonella无明显灭活作用。100 μmol/L Cur介导的PDT可分别使S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella的菌落总数减少2.96、5.79、0.51、2.35（lg（CFU/mL））。然而，当Chi和PDT共同作用时，菌落总数均可减少约8.00（lg（CFU/mL）），Chi-PDT对S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella的灭活菌落数相比于PDT单独作用分别提升了5.66、1.84、8.18、6.30（lg（CFU/mL）），表明Chi对PDT具有显著的协同增效作用。原因可能是Chi增强了Cur的水溶性，进而促进Cur渗透进入细菌，增强PDT的灭活效果，这与Li Tianmin等[23]报道的一致。此外，Chi溶液本身具有黏性和阳离子特性[22]，因此推测Chi可以延长Cur在细菌表面的接触时间，从而加剧PDT对菌体的损伤。

图2 PDT和Chi-PDT对4 种致病菌的灭活效果Fig. 2 Bactericidal efficacy of PDT and Chi-PDT against four pathogens

2.2.2 Cur浓度对Chi-PDT抑菌效果的影响

如图3所示，随着Cur浓度的增加，Chi-PDT的抑菌效果逐渐增强。Cur浓度的增加会使活性氧水平增加，从而增强灭菌效果。0.05% Chi-15 μmol/L Cur可分别使S. aureus和B. cereus的菌落总数减少7.90（lg（CFU/mL））和7.60（lg（CFU/mL）），而灭活相同数量的E. coli和Salmonella则分别需要100 μmol/L和25 μmol/L Cur，说明相比于G＋菌，即使在Chi与PDT协同作用时，也仍然需要更高浓度的光敏剂来杀灭G－菌。Li Tianmin等[23]将0.5% Chi-25 μmol/L Cur和S. aureus共孵育10 min后光照10 min，可使其菌落总数减少5.00（lg（CFU/mL）），其所使用的Chi和Cur剂量较本研究更高，但灭活效果较本研究稍差。G－菌表面具有一层复杂外膜，该外膜是阻碍光敏剂渗透至菌体内的物理屏障[24]，推测这是G－菌对Chi-PDT敏感性较低的关键原因。

图3 Cur浓度对Chi-PDT灭活效果的影响Fig. 3 Influence of Cur concentration on the bactericidal effect of Chi-PDT

2.2.3 光照时间对Chi-PDT灭活效果的影响

如图4所示，Chi-PDT对4 种致病菌的灭活效果随光照时间的延长而增加，最佳灭活效果均出现在光照20 min时，分别使S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella的菌落总数减少了8.00、7.32、4.93、6.06（lg（CFU/mL））。结果表明，Chi-PDT对4 种致病菌的灭活效果均具有光照时间依赖性。光照时间和光功率密度决定光照剂量，有研究表明光照时间对PDT灭活效果的影响大于光功率密度[25]，所以实际食品工业应用过程中可以通过恒定光功率密度、延长光照时间来改善杀菌效果。

图4 光照时间对Chi-PDT灭活效果的影响Fig. 4 Influence of illumination time on the bactericidal effect of Chi-PDT

2.3 Chi-PDT对混合致病菌的灭活效果

如图5所示，15 μmol/L Cur介导的PDT仅可使4 种致病菌混合物的菌落总数减少0.91（lg（CFU/mL））。当0.05% Chi和15 μmol/L Cur协同PDT处理混合菌时，其菌落总数减少6.00（lg（CFU/mL）），即Chi-PDT比PDT单独作用时的抑菌量高5.09（lg（CFU/mL）），且对混合菌的灭活效果与单一菌灭活效果相当。表明Chi-PDT无论是对于单一菌还是混合菌，都比PDT具有更好的灭菌效果。

图5 PDT和Chi-PDT对混合菌的灭菌效果Fig. 5 Bactericidal efficacy of PDT and Chi-PDT on bacterial mixture

目前，大多数对于非热杀菌技术的研究多专注于探究其对单一菌的灭活效果，如Li Tianmin等[23]探究Chi-PDT对S. aureus及其生物膜的灭活效果；Cap等[26]探究高静水压对Salmonella的灭活效果；Gan Zhilin等[27]探究等离子体活化水对E. coli和S. aureus的灭活效果；Kim等[28]采用紫外线-TiO2光催化和高静水压联合处理灭活B. cereus。目前鲜有采用非热杀菌技术灭活G＋菌和G－菌混合物的报道，其中，Kuliesiene等[29]发现采用TiO2光催化灭活Salmonella和E. coli混合物时，其灭活效果不如灭活单一菌；El Kadri等[30]探究大气压冷等离子体对E. coli和单核细胞增生李斯特菌混合生物膜的灭活效果，也发现混合生物膜敏感性较差。本研究结果与上述研究不同，这可能是菌株种类、混合菌株数量和杀菌方式的差异导致的。

2.4 致病菌对Cur的吸收

如图6所示，在Chi存在时，4 种致病菌的荧光强度均显著高于无Chi组。S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella中Chi-Cur组的荧光强度分别比Cur组高122.92、80.67、137.75和104.14。2.2节结果显示Chi可以显著促进PDT的灭菌效果，因此可推测Chi增强了细菌和光敏剂的相互作用，促进了细菌对Cur的吸收。Buchovec等[6]采用Chi与叶绿素PDT协同灭活Salmonella，在扫描电子显微镜视野下发现细菌完全被叶绿素-Chi复合物覆盖，并且发生了明显的膜崩解现象。Liang Zuxin等[8]发现带正电的高分子聚合物ε-聚赖氨酸可促进细菌对Cur的摄取，从而增强Cur的光敏作用。本研究结果也证明Chi可以促进Cur吸附渗透进入细菌内，从而改善PDT的灭活效果。

图6 4 种致病菌对Cur的吸收Fig. 6 Uptake of Cur by four pathogens

2.5 Chi-PDT处理后圣女果在保藏期间活菌数和品质变化

2.5.1Salmonella菌落总数的变化

如图7所示，经检测，未经人工染菌前的圣女果表面不携带Salmonella，染菌后圣女果表面Salmonella的吸附量为6.69（lg（CFU/果））。在保藏前（第0天），100 μmol/L Cur介导的PDT处理对圣女果杀菌效果不显著，然而Chi-PDT可以使Salmonella菌落总数显著降低1.62（lg（CFU/果））。保藏18 d后，对照组圣女果的活菌数量较第0天增加了1.07（lg（CFU/果）），PDT处理组活菌数量增加了0.87（lg（CFU/果）），而Chi-PDT处理组活菌数量没有增加。这说明Chi-PDT能有效地杀灭圣女果表面的Salmonella，并且0.05% Chi-100 μmol/L Cur涂膜协同PDT处理可以较好地抑制Salmonella的生长。Chai Zhengyuan等[4]采用2 μmol/L Cur介导PDT处理鲜切梨10 min，结果使Listeria monocytogenes菌落总数减少3.43（lg（CFU/g）），杀菌效果较本研究更好，推测原因是梨切成平整的薄片后，相比椭球形的圣女果接触光面积更大，且受光照更均匀。Buchovec等[6]使用0.1%Chi-15 μmol/L叶绿素协同PDT处理草莓，可使Salmonella菌落总数减少2.20（lg（CFU/g）），本研究结果与之相近。Jin等[18]用Chi-异硫氰酸烯丙酯涂膜处理感染Salmonella的圣女果，21 d后活菌数从3.65（lg（CFU/果））降到无法检测的水平，其与本研究的效果差异可能在于涂膜液的配制方法不同，该研究为0.9% Chi溶于2%乙酸、乳酸和乙酰丙酸混合溶剂。

图7 圣女果在保藏期间的Salmonella数量Fig. 7 Salmonella counts on cherry tomatoes during storage

2.5.2 色泽变化

对消费者而言，色泽是评价圣女果质量的关键因素之一。如表1所示，L*值在保藏过程中显著降低，但在第18天时Chi-PDT处理组仍显著高于对照组，即Chi-PDT组仍具有较好的光泽。a*值在保藏期间升高，但每个观察日内组间无显著差异，而且18 d后，对照组a*值比PDT处理组增幅更大。b*值在整个保藏过程中无明显变化。成熟度（a*/b*）在保藏期间持续上升，但在第18天各组间无显著差异，即Chi-PDT处理不会对圣女果的色泽和成熟度产生明显影响。美国农业部曾提出圣女果成熟阶段的a*/b*范围应在0.95～1.21之间[19]，而本研究贮藏末期圣女果的a*/b*符合这一推荐范围。因此，PDT处理对圣女果品质无不良影响，并且Chi-Cur涂膜协同PDT处理能使圣女果保持较好的色泽。

表1 圣女果在保藏期间的色泽和硬度变化Table 1 Changes in color and firmness of cherry tomatoes during storage

2.5.3 硬度变化

在整个贮藏期间，圣女果硬度均在1 300 g左右（表1），同一处理组各监测点间和同一监测点不同组间无明显变化，即PDT和Chi-Cur涂膜协同PDT处理不会对圣女果硬度有负面影响。

2.5.4 质量损失情况

由图8可知，保藏时间越长，圣女果质量损失率越高。这是因为圣女果在保藏过程中会发生水分流失，所以质量有轻微的下降，但各处理组间没有显著差异。

图8 圣女果在保藏期间的质量损失率Fig. 8 Mass loss of cherry tomatoes during storage

2.5.5 外观变化

如图9所示，PDT处理后保藏前（第0天）3 组圣女果在颜色上无明显差异，经18 d保藏后3 组圣女果颜色也无显著差异，这与表1结果相印证，表明PDT处理不影响圣女果外观。经过18 d的保藏后，对照组和PDT组中部分圣女果出现发霉腐烂现象，但Chi-PDT组外观完好，并且图7结果显示对照组和PDT组活菌数量在第18天增长了约1.00（lg（CFU/果）），表明0.05% Chi-100 μmol/L Cur涂膜协同PDT处理能有效抑制Salmonella和霉菌的生长繁殖，延长圣女果的保质期。

图9 圣女果保藏前后的外观变化Fig. 9 Changes in visual appearance of cherry tomatoes before and after storage

由此可见，Chi-PDT是一种能有效灭活圣女果表面Salmonella的非热杀菌方法，并且Chi-Cur涂膜协同PDT处理能有效抑制Salmonella的繁殖，同时不会对圣女果的品质产生不良影响，起到了较好的保鲜效果。

3 结 论

本研究选取Chi作为PDT的协同增效剂，结果表明Chi可通过促进细菌对Cur的吸收从而增强PDT的杀菌效果。Chi-Cur协同PDT处理可有效灭活S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella，其灭活效果与Cur浓度和光照时间呈正相关。PDT结合Chi-Cur涂膜可应用于圣女果的抗菌和保藏。

本研究解决了PDT对G－菌灭活效果不理想这一难题，结合PDT和Chi-Cur涂膜技术，解决了圣女果的抗菌保藏问题。但是本研究还存在一定的局限性，后续研究可聚焦于以下几个方面：1）比较PDT和Chi-PDT对细菌芽孢、真菌孢子和病毒的灭活效果，探究Chi是否对于PDT灭活其他微生物亦具有协同增效作用，以拓宽Chi-PDT技术的应用范围；2）研究PDT和Chi-PDT处理后细菌中吸收Cur受体、细胞膜通透性、氧化应激等相关基因表达的变化情况，从分子层面揭示Chi与PDT的协同增效机理；3）深入探究Chi-PDT对圣女果营养成分（如VC、番茄红素、黄酮类化合物和酚类等）含量的影响，助力开发安全、高效及食品品质友好的食品加工技术。