食源性致病菌活的不可培养状态诱导、复苏及检测的研究进展

赵 青，刘 欣，牛洪梅，朱华剑，潘馨叶，刘阳泰，杨捷琳，董庆利,*

（1.上海理工大学材料与化学学院，上海 200093；2.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093；3.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135）

细菌活的不可培养（viable but nonculturable，VBNC）状态，通常是指细菌在不利于自身生存环境条件下失去可培养性的一种休眠状态[1]。Xu Huaishu等[2]最早于1982年发现了VBNC状态存在的直接证据，其后Mukamolova等[3]发现了黄体微球菌分泌的蛋白质Rpf（复苏促进因子），为VBNC状态的研究提供了一个良好的开端。现已有大量的实质性证据表明，大多数细菌在处于对其生长繁殖不利的环境条件时，都能够进入VBNC状态休眠或是降低细胞活性，以规避不良环境条件的影响[4]，这种状态下的细菌仍具有致病性或潜在致病性，并在适宜的条件下可以复苏，因此对食品和环境存在潜在的威胁[5-6]。2018年，Schottroff等[7]阐述了VBNC细菌的存在可能会引起食品安全状况误判，由此引起食品安全事件，并再次强调了VBNC细菌对食品安全的威胁，使VBNC状态细菌的关注度提升。

迄今为止，已经发现的100多种在逆境条件下可以进入VBNC状态的微生物绝大多数为食源性致病菌[8-9]。食源性致病菌可通过受污染的水或食物传播，消费者摄入之后会在人体内引起严重疾病，是影响食品安全的重要隐患，包括沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌等[10]。研究发现当食源性致病菌在食品加工加工过程中遇到低温[11]、高压[12]、低强度光照、高/低盐度[13]、紫外[14]、氯胁迫[15-16]和电化学处理[17]等条件时，有较大可能会进入VBNC状态。进入VBNC状态的致病菌虽然暂时丧失了生长繁殖的能力，但仍具有致病菌原本的抗原成分、毒力因子，且部分致病菌在VBNC状态下可以直接表达毒性因子[18]。细菌处于VBNC状态时，采用常规的检测手段易造成漏检，但当VBNC状态的致病菌遇到适宜的条件后又可以复苏，重新对周围环境和人类安全造成一定的威胁。不同食源性致病菌在VBNC状态下的毒性表达能力也有所不同。因此，出于对食品安全和公众健康的考虑，对食源性致病菌VBNC状态生理生化特性及其检测方法的研究具有积极和重要的意义。

基于此，本文总结了细菌VBNC状态的定义发展、形态特征、生理生化性质、毒力因子等，再将近年来VBNC状态诱导因素和复苏条件进行梳理归纳，最后着重介绍了检测VBNC状态的分子生物学、流式细胞仪、光学检测方法，并比较分析了3 种方法的优劣。通过进行进一步的学术探讨，围绕细菌进入VBNC状态的影响因素和复苏条件进行全面的总结，为防控食源性致病菌的潜在危害提供参考。

1 VBNC状态的定义及特征

1.1 VBNC状态的定义

VBNC状态是指细菌在受到不利于自身生长环境下导致的一种休眠状态，常规培养条件下细菌不能增殖，但是仍具有代谢活性，给予适宜条件时细菌可复苏[19]。通常，保持在VBNC状态的细菌保留了毒力基因和致病基因，复苏后会产生致病性和感染性[20]。如图1所示，VBNC状态细菌菌体中细胞质密度、蛋白质、核糖体、DNA的改变会引起菌体收缩变小，细胞壁和细胞膜也会分离。从近年来的研究看，VBNC状态并没有一个固定的解释，有学者认为其是细菌在不利环境条件下生存的一种休眠状态[21]，另外一些学者认为其是细菌为了延续生命而采取的一种特殊的生存策略[22-24]，总地来说，各种对于VBNC状态的定义都具有不可培养这一共同的外部特征，但对细菌本身缺少一个明确的特征指标。

图1 细菌进入VBNC状态后形态、生理和毒力特征的变化[25]Fig. 1 Changes in morphological, physiological and virulence characteristics of bacteria after entering the VBNC state[25]

1.2 VBNC状态的特征

关于VBNC细胞的特征研究有很多，以下从细胞形态、细胞组织结构、蛋白质大分子方面分别阐述。

1.2.1 细胞形态

从细胞形态看，VBNC状态细胞与指数中期和坏死状态的细胞间存在明显差异。Wei Caijiao等[26]用扫描电子显微镜观察不同状态的细菌细胞发现，处于指数中期的细胞呈典型的棒状，表面光滑、大小正常、分布均匀；死亡的大肠杆菌O157:H7细胞表面相对粗糙、聚集，甚至部分细胞表面出现损伤；而在VBNC状态下，细胞由典型的棒状变为短棒状，细胞体积减小，细胞相对粗糙、萎缩，形状不规则，部分细胞趋于成簇。

1.2.2 组织结构

Bai Hong等[27]从细胞组织结构方面开展典型特征研究，用透射电子显微镜观察未诱导和诱导第20天的VBNC细胞，发现两者有着同样明显的形态学变化。基于微观分子层面，许多未诱导的细胞处于分裂期，细胞壁完整光滑，细胞膜紧密贴合。细胞质和细胞核物质被新生的细胞壁均匀地分离，核糖体均匀分布于整个细胞质基质中，位于细胞中心的类核具有致密、浓缩的结构。与未诱导的细胞相比，VBNC细胞质中电子密度增加，部分细胞出现细胞膜与细胞壁之间的间隙，导致细胞壁有一定程度的变形，使VBNC细胞形态不规则，这可能是细胞质浓缩所致。另一方面，与未诱导的细胞相比，VBNC细胞的细胞核区域出现了电子密度下降的现象，表现为明亮的中空或呈放射状分布的浅色结构。

1.2.3 蛋白质大分子

Bollen等[28]讨论了VBNC状态与蛋白质聚集的关系；Kan Yumin等[29]采用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技术比较了西瓜噬酸菌VBNC细胞、复苏细胞和对数期细胞的蛋白图谱，在VBNC细胞和对数期细胞的对比中有60 个蛋白差异表达，在VBNC细胞和复苏细胞的对比中有469 个蛋白差异表达。Zhong Qingping等[30]同样采用iTRAQ技术对副溶血性弧菌复苏后与VBNC状态和指数期的蛋白质组学进行分析，证明了复苏细胞中蛋白全面上调，主要包括参与蛋白质合成、跨膜转运、分泌系统、运动、黏附等生命过程的蛋白；Se Jing等[31]研究了在低水分的情况下细菌细胞的形态、蛋白质合成和DNA复制能力；Ye Chengsong等[32]通过转录组分析发现，在VBNC状态下，大肠杆菌共有16 个基因表达显著上调，其中包括3 个编码毒性蛋白的基因（ygeG、ibsD、shoB）。以上研究表明在VBNC状态下，细菌细胞的培养能力、蛋白质合成和DNA复制能力降低，其中参与DNA复制和重组、糖类运输和代谢的蛋白均下调，与鞭毛运动、致病性和营养吸收相关的蛋白均上调；同时，该研究也证实了处于VBNC状态的细菌在复苏后表达致病蛋白，对人类健康安全构成威胁。

2 细菌进入VBNC状态的因素及复苏条件

2.1 VBNC状态细菌形成

1982年，Xu Huaishu等[2]首次在海洋和河口水中分离获得VBNC细胞并对其状态进行了描述，之后在自来水、海底沉积物或土壤中都检测到了VBNC状态细胞存在。此外，在一些食品中也发现了VBNC状态细菌的存在，如饮用水、葡萄酒、啤酒、葡萄果汁、成熟苹果果核、生菜、欧芹等[33]。这是因为在食品加工及贮藏过程中存在着许多能够导致食品中所含致病菌被迫进入VBNC状态的环境因素，主要包括低温、高温、高渗透压、低氧浓度、极端pH值、寡营养等[20]。换言之，在外界环境中能使细菌偏离最佳生长条件的胁迫因素（包括物理因素和化学因素）均可能使细菌进入VBNC状态。

图2为VBNC细菌的形成机制示意图，主要涉及4 条通路，包括毒素-抗毒素（toxin-antitoxi，TA）系统、严紧反应、一般应激反应和细胞膜作用。1）在TA系统中，对细菌VBNC状态起调控作用的毒素基因（mazF、relE、higB、hipB、vapC、parE2）干扰翻译，抑制细菌生长，使细菌进入VBNC状态。TA系统又受严紧反应调节，因为外切聚磷酸激酶（polyphosphokinase，PPK）和鸟苷五磷酸磷酸水解酶（guanosine pentaphosphate phosphohydrolase，GPPA）具有鸟苷四磷酸[(p)ppGpp]磷酸水解酶活性，导致降解多聚磷酸盐（polyphosphates，PolyP）积聚，从而激活蛋白酶Lon/ClpP并降解抗毒素，促进细菌进入VBNC状态（图2A）。2）在严紧反应中，由于氨基酸饥饿而激活RelA蛋白，(p)ppGpp又受RelA催化合成，进而影响DNA、RNA和蛋白质的合成，导致生长停滞（图2B）。3）一般应激反应系统Sigma因子RpoS和转录调控因子OxyR作为调节应激反应的主要信号因子对VBNC细菌的形成和作用具有重要的激活作用，RpoS也受严紧反应和ClpX蛋白酶的调控，clpX基因突变导致RpoS降解减少，最终延迟细胞进入VBNC状态（图2C）。4）细胞膜上的毒素转录激活因子ToxR的降解也会导致细菌进入VBNC状态，其功能可能是对环境信号的响应[25]（图2D）。

图2 VBNC细胞的形成机制[25]Fig. 2 Formation mechanism of VBNC cells[25]

2.2 VBNC状态细菌复苏

VBNC状态细菌复苏是一个复杂的过程，并不只是通过简单除去环境胁迫因素来实现，有时还需要添加营养物质、化学物质或依靠食品基质来实现，而且并不是所有的VBNC菌株都可以复苏。处于VBNC状态的细菌具有一定的可复苏的“复苏窗口期”[34]，一旦过了这个窗口期，复苏难度较大，并且窗口期在不同菌株之间差异很大。目前关于VBNC状态菌的研究较多，但研究VBNC状态复苏成功与否却存在争议，关于复苏的是亚致死细胞还是VBNC细胞尚不清楚，且这两者有极大的相似之处。亚致死状态是由于化学或物理过程而受到细胞结构的损伤，但没有被杀死，并且有能力在适当的条件下修复它们的损伤时，它们就处于亚致死状态。亚致死细胞是休眠的初始阶段，随后是VBNC状态[33]。此外，同样的复苏方法对不同种类的细菌有不同的复苏效果，甚至同一细菌不同菌株的复苏效果也不一样。例如，Pinto等[35]发现氨基酸可以使溶血性大肠杆菌的VBNC细胞复苏，但不能使VBNC肠出血性大肠杆菌O157:H7复苏。Wagley等[36]研究发现菌株的“年龄”也可影响VBNC的形成和复苏。在Afari等[37]的研究中，大肠杆菌O157:H7撤去应激条件，升温加丙酮酸钠和吐温20即复苏成功，但同样条件下单增李斯特菌的复苏却未成功。

复苏VBNC状态下的细胞一般为消除压力因素或添加营养物质，但复苏的分子机制并不是一个简单的逆转过程，图3为VBNC状态细胞复苏机制示意图[38]。在靶向自诱导信号分子（autoinducer-2，AI-2）缺失的情况下，其受体由周质结合蛋白LuxP和酶传感器LuxQ结合LuxPQ作为激酶催化组氨酸磷酸化，磷酸盐随后转移到酶蛋白LuxU和转录调节因子LuxO。LuxU和转录调节因子σ54结合促进了sRNAs的转录，sRNAs与伴侣Hfq一起破坏了转录因子LuxR的编码。LuxR是RpoS的正调控因子，LuxR被破坏后，RpoS活性降低，过氧化氢酶KatG的产生也会随之减少，进而导致细胞对过氧化氢的敏感性和不可培养性（图3A）。当AI-2浓度较高时，LuxPQ结合AI-2，并作为磷酸酶剥夺LuxO和LuxU的磷酸基，低活性LuxO导致LuxR失去抑制后，RpoS活性的增加导致KatG产量的增加，抗氧化活性的增加使VBNC细胞再次可培养（图3B）。Rpf蛋白结合VBNC细胞表面的Rpf受体，触发复苏（图3C）。Rpf和Rif组成的复合物作用于细胞壁。Rpf和Rip分别分裂糖苷键和肽键，细胞壁被重塑，进而刺激VBNC细胞的复苏（图3D）。Rpf和Rif复合体作用于VBNC细胞的细胞壁，并将其裂解产生肽聚糖片段。肽聚糖片段与PknB受体（一种跨膜蛋白）结合并触发复苏（图3E）。VBNC细胞在去除氧化、冷、饥饿、渗透应激和离子应激等应激后可以复苏（图3F）。VBNC细胞宿主可提供营养或刺激因子促进复苏[38]（图3G）。

图3 VBNC细胞的复苏机制[38]Fig. 3 Resuscitation model of VBNC cells[38]

为了解食源性致病菌VBNC状态及其复苏后对人类的威胁，已对食源性致病菌VBNC状态的影响因素和复苏条件开展了相关研究（表1）。典型研究包括通过物理方法诱导致病菌进入VBNC状态，包括紫外线[39]、高温[40]、低水分[31]、高压二氧化碳[41]，而复苏后致病菌可恢复其培养性和代谢活性，证实了毒力基因在VBNC状态和复苏的细胞中均为高表达，但随着蛋白质聚集和活性氧水平的增加，细胞会逐渐失去复苏的能力；Liu Yanming[42]、Phung[43]、Gião[44]等的研究表明自来水中也存在VBNC状态的细菌，所以为消除这一潜在风险，需要将水煮沸至少15 min以上使其完全灭活；Zolfaghari等[45]发现单增李斯特菌在NaCl溶液的胁迫下进入VBNC状态，且保留了hly和inlA基因的表达；此外，在营养耗尽的培养基中也可诱导细菌进入VBNC状态，并且细菌存活时长可达2 个月[46-47]。由此可以得出，细菌在不利于自身生长繁殖的物理或化学条件下，均可进入VBNC状态，而不同的食源性致病菌进入VBNC状态的时间、条件也不相同，这可能与致病菌本身的生存环境、生存温度、营养需求、耐酸碱度有关。

表1 食源性致病菌VBNC状态的影响因素及复苏条件Table 1 Influential factors and resuscitation conditions of foodborne pathogens in the VBNC state

3 VBNC细菌检测方法

由于VBNC状态细菌使用常规培养方法无法增殖，因此无法被检测到，容易对食品安全和公共卫生形成潜在威胁。因此建立针对VBNC状态的食源性致病菌有效且快速检测的方法较为迫切。目前针对VBNC状态的食源性致病菌的检测方法主要包括分子生物学检测法、流式细胞术和光学检测法。

3.1 分子生物学检测法

分子生物学检测法一般采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测细胞总数，叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）能够进入细胞壁和细胞膜已破损的细胞，但由于VBNC状态下的细菌细胞膜是完整的，因此PMA只能对死细胞进行染色，一般将其与PCR结合测VBNC细胞数，或将qPCR与活/死细胞染色法结合得出总细胞数、活细胞和死细胞数，通过总细胞数和活细胞数差值来确定VBNC细胞数。

Zhou Wenqu等[60]应用快速、特异、操作简便的单氮丙啶交叉引物扩增（propidium monoazide-crossing priming amplification，PMA-CPA）法检测VBNC状态下的大肠杆菌O157:H7。Debnath等[61]通过qPCR对VBNC状态下的霍乱弧菌分析，证实了此状态下细菌具有活性。可以推测，在逆境中生存时，这些分子伴侣的作用是维持重要蛋白的结构完整性。Faille等[62]用qPCR和PMA-qPCR分别对单增李斯特菌死亡、VBNC、可培养细胞计数，发现使用的采样方法对清洗消毒操作效率的评估有显著影响。Li Yanmei团队[63-64]用PMA-PCR计数进行研究，发现了营养、酸、盐对金黄色葡萄球菌（营养＞酸＞盐）和大肠杆菌O157:H7（酸＞营养＞盐）的影响。Lv Xinrui等[65]开发并使用PMAxx（以分子检测法为主，对PMA染料进行改良后的一种方法）＋单细胞数字滴定PCR（single intact cell droplet digital PCR，SIC ddPCR）法对婴儿食品中阪崎克罗诺杆菌在VBNC状态下快速定量检测，得出检测限2.3×101CFU/mL，且仅需3 h就可得出结果，并且具有较高的灵敏度和准确性。分子生物学检测法以准确、灵敏度高、特异性强并且能够极大提高检测速度等优势在VBNC状态细菌的检测和分析中得到了广泛的应用。但是，分子检测法也有一定的劣势，比如其程序复杂，需要技术精通的研究人员操作，同时检测仪器也十分昂贵。

3.2 流式细胞术

流式细胞术可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞并进行自动分析和分选，该技术可以用于分析和检测那些不能用常规方法培养而得到的细胞特征参数。Live/Dead BacLight试剂盒是目前应用较多的判定活菌的方法，采用流式细胞术可以区分出只被SYTO9染色的细菌，从而得到活菌的含量，而检测到细胞处于活细胞区但平板富集后不可培养的细胞被归类为VBNC细胞。

Afari等[37]采用流式细胞仪，Live/Dead BacLight试剂盒对大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌VBNC状态细胞的活性进行评估，得出初始细菌种群规模大小影响电解水处理过程中的细菌减少程度。Power等[66]研究证明，高通量成像流式细胞术（imaging flow cytometry，IFC）具有高通量数据收集和图像捕获能力，可对细胞进行可视化处理并提供详细的形态分析，因此可以对VBNC细胞进行高分辨率分类，为详细了解细菌表型变化及其生理影响提供了一个平台，可以准确监测和量化，从而更好地理解表型异质性在动态微生物组中的作用。具备筛选功能的流式细胞仪可以根据预先设置的参数范围把指定的细胞亚群分选出来，但多数流式细胞计是一种细节分辨率为零的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量、总蛋白量等指标，而不能鉴别和测量出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。

3.3 光学检测法

荧光显微镜法是研究VBNC状态菌最基本的检测方法，也称经典方法。该方法是以吖啶橙染色荧光显微镜直接镜检（acridine orange direct count，AODC）法、活菌直接镜检（direct viable count，DVC）法和异养平板计数（heterotrophic plate count，HPC）法三者相结合实现对VBNC状态菌的计数。

Zhu Lin等[67]通过Live/Dead BacLight细菌活力试剂盒、5-氰基-2,3-二聚四唑（5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride，CTC）对活细胞进行染色结合HPC的方法对死、活、可培养细胞计数，从而计算出VBNC细胞数。Du Meng等[68]用AODC、DVC结合的方法检测溶藻弧菌，发现4 ℃条件下总细胞数不变，但活菌数明显下降，说明有大量细胞进入VBNC状态。García-Hernández等[69]采用DVC和荧光原位（fluorescentin situhybridization，FISH）杂交技术（DVC-FISH）和传统平板培养法，在不同温度下对人工污染的食物基质中感染致病菌的活细胞进行检测和量化，总检测和鉴定时间缩短了4 h，可以很好地弥补传统培养方法检测的缺点。光学检测法结果直观、清晰，但是细菌种类之间没有区分，可能导致对目标菌株的错误判断。表2为常见的食源性致病菌VBNC状态检测方法比较。

表2 食源性致病菌VBNC状态检测方法比较Table 2 Molecular assays for detecting VBNC state of foodborne pathogens

为研究VBNC状态的细菌，除了上述3 种主要的检测方法外，还有酶分析法、种群基因检测法、PMA-CPA检测、免疫荧光和免疫传感器等方法[80-81]。而大多数方法只考虑了1 种存活参数，如呼吸活性、膜完整性、代谢活性[82]，有一定的局限性。所以测定细胞的活力参数时，需要将几种方式结合，从细胞的形态、呼吸活性和酶活性等方面进行全面分析，使结果更有说服力。并且针对不同的致病菌、实验条件、研究内容，必须谨慎选择各自的方法。

4 结 语

食源性致病菌可在不利于自身生长的环境条件下进入VBNC状态来维持自身生存，反观大多数影响致病菌进入VBNC状态的条件与食品生产加工存储方式密切相关，如低温冷藏、高温消毒、紫外线杀菌以及食品添加剂等。进入VBNC状态而未被杀死的食源性致病菌，一方面会导致常规方法对食源性致病菌VBNC状态的漏检，另一方面会造成食品安全问题。因此针对目前食源性致病菌VBNC状态的研究展望如下：1）加强对VBNC细菌复苏条件优化的研究。从目前的研究来看，VBNC状态细菌复苏主要是采用简单的升温和培养基内添加营养物质的方式，今后应考虑依靠食品基质来提供营养条件复苏，如把VBNC状态的致病菌接种在新鲜水果、蔬菜、肉类上以实现复苏，这样更加接近于食源性致病菌的生存环境；2）深入探讨细菌进入VBNC状态后与正常生理状态下的转录组学差异。目前的研究主要集中在影响细菌进入VBNC的因素，缺乏针对食源性致病菌VBNC状态以及复苏状态下全面的毒力基因、耐药基因、运动相关基因等的表达；目前关于细菌VBNC状态形成及复苏机制研究较少，且不同菌的生理生化特性不同，很难建立统一的机制；在以后的研究中通过转录组学和蛋白组学的联合分析，研究VBNC状态形成机制和复苏机制可能是未来食源性致病菌VBNC状态研究的一个热点；3）研发针对VBNC状态细菌更加全面有效的检测方法。现有方法来看还存在一些不足，如目前对于VBNC状态细菌的检测还无法区分不同状态下的细菌，需要提高灵敏度和精确度，开发更多、更简便的检测方法来避免漏检情况出现，为食品安全检测、疾病预防提供更为有效的方法和途径；4）深入探讨细菌进入VBNC状态的时间。由于检测方法的限制，大部分VBNC细菌仍会逃过检测，并且也无法判断分离检测出的细菌进入VBNC状态的时间，对人类的危害风险评估仍是一个难点；5）研发分离VBNC状态菌的方法。分离VBNC状态菌也是非常困难的，需要研发更准确、高效的技术来突破这一难关；6）深入研究亚致死损伤细胞、休眠细胞、VBNC细胞之间的区别。目前虽有大量研究证明VBNC状态细胞可以复苏成功，但研究VBNC状态复苏成功与否却存在争议，关于复苏的是亚致死细胞还是VBNC细胞尚不清楚，且这两者有极大的相似之处，因此需要深入探讨这几种细胞之间的生理生化特性，以判断真正被复苏的细胞。