核因子－ｋＢ对急性缺血－再灌流心肌细胞凋亡及左室局部功能的影响

林　萍　任卫东　王朝晖　刘长宏　武　俊　王月爱

【摘要】目的探讨核因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)对急性缺血一再灌流心肌细胞凋亡及左室局部功能的影响。方法24只健康杂种犬随机分为对照组(c组)、缺血一再灌流组(IR组)和缺血一再灌流加特异性NF-kB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷组(PDTC组)。IR组于第一对角支以下1cm处套扎左冠状动脉前降支30 min，恢复血流再灌流120 min，PDTC组在心肌缺血前应用PDTC(100 mg／kg)，C组游离左冠状动脉前降支不结扎。超声心动图中的应变率法测量左室局部收缩功能，simpsons双平面法测左室射血分数(EF)，应用脱氧核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)测心肌细胞凋亡指数，免疫组化法及蛋白印迹(western-blot)检测心肌组织中NF-kB的表达。结果IR组NF-kB在缺血心肌组织中表达增高，显著高于C组(P＜0.05)，而PDTC组NF-kB表达明显减弱，显著低于IR组(P＜0.05)；PDTc组心肌细胞凋亡数较IR组明显减少(P＜0.05)；IR组左室前壁缺血节段收缩期峰值应变率(SRpeak)明显减低(P＜0.01)，PDTC组的应变率与IR组比较明显增高(P＜0.05)。射血分数在三组间差异无统计学意义。结论NF-kB在心肌缺血一再灌流中起重要作用，PDTC通过抑制NF-kB的表达从而减轻心肌缺血一再灌流损伤，改善心功能。

【关键词】核因子-kB；心肌；缺血-再灌流；细胞凋亡

NF-kB广泛存在于包括心肌细胞，血管内皮细胞在内的各种细胞，通常以非活化状态存在于细胞浆中，当机体在外界因素刺激如细胞因子、缺血、低氧刺激作用下开始激活，由细胞浆转移至细胞核，可能是诱发细胞凋亡的机制。而细胞凋亡可影响心功能，应变率成像是在多普勒组织成像发展起来的新技术，可以反映局部心肌功能，且不受整体心肌运动的影响。因此，本实验应用特异性NF-kB抑制剂PDTC研究其对缺血．再灌流心肌细胞凋亡及局部功能的影响，探讨NF-kB在缺血一再灌流心肌中的作用，为进一步研究缺血一再灌流的发病机制及诊疗措施提供依据。

1材料与方法

1．1动物及分组

健康杂种犬24只(大连医科大学动物中心提供)，其中雌性14只，雄性10只，体质量(10.2±2.4)kg，随机均分三组(n=8)：对照组(C组)，缺血-再灌流(IR组)及缺血一再灌流加NF-kB抑制剂组(PDTC组)。3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于实验台上，行股动脉插管监测动脉压，体表连心电图，气管插管连呼吸机正压人工呼吸，取胸骨正中切口开胸，剪开心包制成心包吊篮；IR组结扎左冠状动脉前降支(LAD)30 min后再灌流120 min；PDTC组结扎前30 min静推PDTC(100mg／kg)，余方法同IR组，对照组仅与第一对角支起点以下1 cm处穿线，不结扎。实验结束后取IR组及PDTC组左室前壁缺血部位及C组相应部位心肌组织，存于10％中性甲醛液及液氮中保存备用。

1．2实验材料

原位细胞凋亡试剂盒碱性磷酸酶法(TUNEL)购于德国Roche公司，NF-kB免疫组化试剂盒购于美国Neomarkers公司，PDTC购于美国Sigma公司。

1．3左室整体及局部功能测量

使用美国GE公司Vivid7超声仪，探头频率3.5 MHz，分别采集并储存三组犬心尖四腔、两腔和左室长轴切面的三个完整心动周期的动态组织速度图，启动应变率分析软件，将取样点置于心内膜下心肌组织中，以同步心电图波形划分收缩期和舒张期。Simpson's双平面法测量左室射血分数。每幅图像测三次取平均值。

1．4TUNEL法测心肌细胞凋亡

取三组甲醛固定24 h后心肌组织，石蜡切片厚5 μm，按照Roche公司试剂盒步骤检测细胞凋亡，镜下观察，每张玻片上随机选取5个区域，每个区域计数100个细胞，计算每100个细胞中的凋亡细胞数，即凋亡指数(AI)。

1．5免疫组化法测NF-kB表达

将待检心肌标本用10％中性缓冲甲醛液固定18 h。脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋。切片厚4μm，脱蜡至水。3％H₂O₂室温10 min灭活内源性过氧化物酶，PBS洗5 min，95℃微波10 min修复抗原活性，5％血清封闭，滴加1：200抗犬NF-kB抗体，4℃孵育过夜。PBS洗5 min，滴加荧光素化相应二抗，37℃孵育20 min，PBS洗5 min，加链霉素一荧光素一过氧化物酶复合物，37℃孵育20min，PBS洗5 min。二氨基联苯胺(DAB)显色。每张玻片上随机选取5个区域，每个区域计数100个细胞，计算每100个细胞中的阳性细胞数，即阳性细胞指数。

1．6蛋白印迹分析(Western-blot)定量检测NF-kB的表达

按参考文献方法行核蛋白提取，Forlin-酚蛋白定量法行蛋白浓度测定。取50 μg核蛋白行10％SDS-PAGE蛋白电泳并将蛋白转至硝酸纤维素膜上，转移后的NC膜于封闭液中37℃封闭2 h，一抗为兔抗犬NF-kB抗体(1：200)，二抗为辣根过氧化物酶标化的羊抗兔抗体(1：10000)，最后通过DAB显色。计算机扫描，采用图象分析软件(Lab－work3.0)比较目的条带吸光度值(A Value)。

1．7统计学方法

使用SPSS 10.0统计学软件系统，数据以均数±標准差(χ±s)表示，多个样本均数比较采用方差分析，组间两两比较选用q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1左室心功能

C组左室前壁中间段的收缩期峰值应变率(SRpeak)为负值，表示心肌缩短。IR组左室前壁收缩期SRpeak峰值明显减低，几乎呈直线水平，与对照组比差异具有统计学意义(P＜0.01)，PDTC组左室前壁中间段的SRpeak值明显增高，与IR组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。射血分数在三组间差异无统计学意义。

2．2TUNEL标记的凋亡细胞数

C组各视野偶见TUNEL阳性标记的细胞。IR组缺血区TUNEL凋亡指数显著增加，与C组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)；PDTC组心肌TUNEL凋亡指数较c组差异虽具有统计学意义，但与IR组比较已明显减少(P＜0.05)。

2．3免疫组化法测NF-kB的表达

与C组比较，IR组NF-kB阳性细胞指数明显增加(P＜0.01)，而PDTC组的阳性细胞指数与c组比较差异仍具有统计学意义(P＜0.05)，但PDTC组与IR组比较已明显减少(P＜0.05)。

2．4Western-blot法定量NF-kB的表达

IR组核蛋白NF-kB表达增加[吸光度值：(38.7±8.2)us(62.3±10.3)，q=4.43，P＜0.01]；PDTC抑制NF-kB活化[(62.3±10.3)us(31.9±6.5)，g=5.62，P＜0.01]。

3讨论

在哺乳动物细胞中已发现NF-kB蛋白家族五个成员：RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-kB1(p50／p105)和NF-kB2(p52／p100)。NF-kB蛋白家族通常以同源或异源二聚体形式存在于大多数细胞浆中。在静息状态下，NF-kB通常以无活性状态与其抑制蛋白IkB结合存在于细胞浆中。当细胞受到各种刺激(包括细胞因子、缺氧、病毒、细菌感染等)后，IkB磷酸化，从而使NF-kB活化，由胞浆转移到细胞核内，与基因操纵子的NF-kB特异性位点结合，启动基因转录。Li等用凝胶电泳迁移率变化分析缺血-再灌流模型大鼠和对照组大鼠心肌的NF-kB DNA结合活性发现，对照组只有低水平的DNA结合活性；而实验组在心肌缺血-再灌流15 min至3 h均出现NF-kB的结合活性增高。本实验发现，急性心肌缺血．再灌流可以激活NF-kB，产生细胞核表达，定量NF-KB蛋白表达明显增加，这与Altavilla等的研究结果相符。目前，关于NF-kB在缺血－再灌流细胞凋亡中的作用不明确。Ionoue等研究认为，再灌流后激活NF-kB，具有抗凋亡作用，但是Shou等认为NF-kB还具有促凋亡的作用。由于NF-kB的靶基因上存在众多功能性的kB结合位点，激活后可能诱导抗凋亡基因的表达，也可能诱导促凋亡基因的表达，至于诱导哪一类基因，依赖于刺激信号的差异和细胞类型的不同。笔者的研究显示缺血一再灌流后心肌细胞大量凋亡并伴有缺血区域局部心肌功能的障碍。应用PDTC抑制NF-kB的活性后则明显减少再灌注心肌细胞凋亡数，改善心功能。提示NF-kB可能是参与调控急性缺血-再灌流细胞凋亡的重要因子。

临床研究中以抑制NF-kB活化为目的减轻急性缺血-再灌流损伤是目前从基因水平上探索的新途径。眾多研究人员发现，许多药物包括肝素、腺苷、水杨酸制剂、维生素E样抗氧化剂、吡咯烷甲基四环素等都通过各种途径不同程度的阻断NF-kB的激活，从而起到预防缺血-再灌注心肌损伤的作用，减少心肌细胞凋亡，改善心功能。

本研究证实，急性心肌缺血-再灌流NF-kB激活，心肌细胞凋亡可能为其早期的病理改变，并且与心肌局部收缩功能密切相关。适度干预NF-kB活化将会减少细胞凋亡改善心功能，其作用具体的分子生物学机制还有待于进一步研究。