胎鼠中脑腹侧与额叶皮质神经干细胞生物特性差异的比较

刘 兵 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

欧 微 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院内科，湖北 荆州 434000)

彭超华 (武汉工业学院医学院，湖北 武汉 430023)

胎鼠中脑腹侧与额叶皮质神经干细胞生物特性差异的比较

刘 兵 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

欧 微 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院内科，湖北 荆州 434000)

彭超华 (武汉工业学院医学院，湖北 武汉 430023)

目的：比较昆明小鼠胚胎中脑腹侧与额叶皮质来源的神经干细胞生物特性的差异，为更好的研究和利用神经干细胞奠定基础。方法：无菌条件下分离胚鼠中脑腹侧组织与额叶皮质，经消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基，培养扩增；倒置显微镜观察比较生长状况；机械方法传代；10%血清接种分化；免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，并作比较。结果：小鼠胚胎中脑腹侧与额叶皮质均存在神经干细胞，其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性；但额叶皮质所含神经干细胞明显多于中脑腹侧，也更宜成球；结论：同样条件下，额叶皮质神经干细胞比中脑腹侧神经干细胞更易培养与增殖，但分化较晚。

神经干细胞；分离；培养；差异

神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一种具有自我更新及多向分化潜能的细胞。它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的若干区域。在成年哺乳动物和晚期胚胎中，NSCs存在的部位和数量都较少，而在早期胚胎中枢神经系统中NSCs则广泛存在。 但进年研究同时表明，不同脑区来源的NSC特性并不完全相同，即NSC的“区域差异性”(regional differentions)[1]。胎脑皮质是NSC的常用取材区; 腹侧中脑是多巴胺能神经元的发源地,已被有些实验室证实存在神经干细胞[2，3]。为在体外得到足够数量的DA能神经元以提供PD细胞移植供体，本研究分别从昆明胎鼠大脑中脑腹侧和皮质分离出神经干细胞，旨在比较以上两个区域来源的NSCs在分离培养方面的差异 ，深入了解神经干细胞的生物学特性，为进一步探讨小鼠胚胎NSC移植的临床研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 孕11～15d昆明小鼠(E11-E15d SPF级)由武汉大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂 DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司(USA)；碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司(USA); 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司(USA)。抗体：羊抗鼠anti-nestin单克隆一抗及相应的荧光标记二抗；小鼠抗大鼠anti-TH单克隆一抗以及相应的荧光标记二抗均购自美国Alpha Diagnostic Intl.Inc公司；其余试剂均为市购。

1.2方法两种NSCs的分离、原代培养、传代培养、分化和免疫细胞化学鉴定见文献[4，5]。

2 结 果

2.1中脑NSC的原代及传代培养细胞孕12～13d的胚鼠中脑腹侧组织以5×105/ml单细胞悬液接种时，中脑神经干细胞经台盼兰染色示细胞胞体较小，24h后可见大量细胞呈碎渣样死亡，死亡细胞几乎达到一半，存活细胞沉底、圆形、晶亮，未见突起，同时皿底也可见散在分布的突起状细胞。36h后细胞形成2～5个细胞的聚集体，还可见许多漂浮的碎片样聚集物(见第90页彩色图版Ⅲ之图1)，4d时聚集体增大形成几十个细胞的神经球，细胞之间界限不很清楚，球状团块周围有光晕，呈悬浮状态，此为典型的神经干细胞球。6d时神经球直径约10～15μm(×100)，分布约50～80个/cm2，活力较好。培养至7天时，球体较大，神经球直径可达15～20μm(×100)(见第90页彩色图版Ⅲ之图2)。在7～10d的培养期间，可见部分原先悬浮的神经球贴附于未包被任何基质的皿底，并伸出细长丝状联系与短的突起，其余神经球仍呈悬浮生长，这一现象随培养时间的延长而增多。中脑NSCs传代培养生长性状基本同原代，经机械吹打传代后死亡细胞较多，部分单细胞2d后出现分裂相，随后逐渐形成神经球，生长速度基本同原代。

图1 原代培养36h中脑神经干细胞(×100) 图2 原代培养7d中脑神经干细胞(×100)

图3 原代培养36h的皮质神经干细胞(×100) 图4 原代培养6d的皮质神经干细胞(×100)

图5 有血清分化6d皮质神经干细胞(×100) 图6 中脑神经球Nestin染色呈阳性(×100)

2.2皮质NSC的原代及传代培养细胞接种早期的额叶皮质干细胞胞体较中脑的略大，圆形，未见突起，光镜下折光性好，晶亮；24h可见大部分细胞沉底，无突起，细胞间有少量死亡细胞呈碎渣样；36h可见沉底的细胞形成5～10个细胞的聚集体(见第90页彩色图版Ⅲ之图3)；2d可见聚集体增大，悬浮，形成十几个细胞的神经球(neurosphere),以后细胞球继续增大，5～7d细胞球直径可达20～25μm(×100)，此时神经球分布约50～100个/cm2，球体均匀致密，细胞晶莹透亮，周边可见明显分裂相细胞(见第90页彩色图版Ⅲ之图4)；继续生长球体直径增大，中央出现黄褐色，为营养缺乏所致。我们证实连续培养14d神经球不贴壁但后期增长速度明显放慢，细胞球因营养缺乏而成片聚集死亡。经机械吹打传代后死亡细胞很多，部分单细胞2d后出现分裂相，随后渐形成细胞团及神经球，生长速度基本同原代；未被完全吹散的部分神经球可见迅速在周边长出新的折光性强而透亮的细胞，再次成球；而部分未被完全吹散的神经球可能由于机械吹打损伤而死亡。

2.3两种NSC的分化将培养的神经球转入有血清培养时，3h即可看到细胞球贴壁，12h可看到贴壁细胞球伸出细长突起；3d左右形态明显的神经元和胶质细胞从细胞球中迁移出来，突起延长增粗，细胞与细胞之间突起形成网状纤维联系；随着时间延长突起继续延长增多、球体之间也形成大的纤维网络(中脑与皮质类似)(见第90页彩色图版Ⅲ之图5)。中脑神经球体10d左右可完全分化为神经细胞和胶质细胞，而皮质球则约需要2～3周。

小鼠胚脑中脑与皮质细胞体外培养传代形成的神经球经免疫荧光染色显示，神经球细胞表达巢蛋白(nestin)抗原(见第90页彩色图版Ⅲ之图6)，能分化为神经元和胶质细胞，表明它们属于神经干细胞。

3 讨 论

神经干细胞普遍存在于胎脑内，但神经干细胞并不是指某一种特定的、单一类型的细胞,而是具有相类似性质的细胞群。我们在实验中对来源于小鼠胎脑皮质和中脑的神经干细胞进行了成功的分离、培养和传代。培养的神经干细胞形成神经球，这是神经干细胞悬浮培养的重要特征。神经球表达Nestin这种特异性的标记物，以及能分化为神经元和交织细胞，证实了其干细胞属性。不同区域来源的NSCs具有不同的生长特性，这一点在我们的实验中得到了证实。

在本实验中，我们发现皮质和中脑来源的神经干细胞在生长特性方面存在如下不同：①分离方面。在整个实验中，我们取过孕11～15d的小鼠，从细胞存活与操作技术方面综合考虑，孕11～13d是中脑取材较佳的时机，而对于皮质区孕13～15d取材最佳。这是因为胚胎天数越小，腹侧中脑的存活率越高，但也给取材操作尤其是皮质的分离带来不便，此时脑实质与脑膜分离很困难，造成NSC的纯度不高。实验中我们也发现分离的腹侧中脑组织较硬，细胞较难分离，认为机械吹打分离对中脑较宜，我们认为对消化的把握是培养成功与否的关键。②培养方面。神经干细胞的存活与生长需要一定的细胞密度支持。本研究中我们发现皮质NSC以(2～3)×105接种为宜，细胞存活率约为80%；而中脑NSC的细胞存活率不到1%，因此要适当提高中脑区细胞的接种密度，且为了防止死细胞影响建议加入DNAase,阻止死细胞核酸粘连。中脑NSC以5×105接种为宜，③生长方面。从本实验结果可以看出相同种植条件下皮质NSC比中脑NSC形成神经球要早，球体直径要大，克隆形成率也高的多，这可能由于：中脑NSC比皮质区少，干细胞的生长密度依赖性限制了中脑NSC的成球[6]；此外，二者由于细胞亚群不同，对丝裂原信号bFGF的反应不同。bFGF对皮质NSC的刺激较强，而中脑NSC对表皮生长因子(EGF)的反应更剧[7]。根据上述情况，我们认为同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞要易于培养与增殖。

神经干细胞在分化上具有多能性，即它们都具有分化为神经元和神经胶质细胞的能力，这在我们的实验中得到证实，即无论是皮质神经干细胞还是中脑神经干细胞均可以分化为神经元和神经胶质细胞。但它们存在“区域差异性”，即不同部位来源的神经干细胞具有不同的生长与分化特异性， 我们在实验中发现，中脑区NSC分化的速度明显快于皮质区NSC.两种NSCs球转入有血清培养时，神经干细胞球贴壁与开始伸出突起的时间无明显差异，但分化4～5d后，两者分化速度出现差别，中脑NSC快，而皮质NSC则要慢。具体而言，增殖7d的神经球，中脑NSC10天左右可以完全分化开，而皮质NSC则需要约3周的时间。分化速度上的差异是其“区域差异性”的表现之一。

总之，中脑NSC与皮质NSC在分离、培养上存在典型的“区域差异性”，皮质NSC更易于培养和增殖。体内神经干细胞的证实及神经干细胞分离培养方法的建立为治疗神经退行性疾病如老年痴呆、帕金森病提供了可靠的基础。

[1]Ostenfeld T, Joly E, Tai YT,etal. Regional specification of rodent and human neurospheres[J]. Dev Brain Res，2002，134：43-55.

[2]Samina SR, Eric J, Gerald M S,etal. The controlled conversion of human neural progenitor cells derived from foetal ventral mesencephalon into dopaminergic neurons in vitro[J]. Dev Brain Res，2002，136：27-34.

[3]Nishino H, Hida H, Baba H,etal. Mesencephalic neurla stem (progenitor) cells develop to dapaminergic neurons strongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum[J]. Exp Neurol，2000, 164：209-214.

[4]刘兵，刘洪涛. 小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化[J].长江大学学报(自科版)医学卷，2006，3(4)：252-254.

[5]刘兵，欧微，刘洪涛. 胚鼠额叶皮质神经干细胞分离培养及分化[J]. 长江大学学报(自科版)医学卷，2009，6(3)：8-10.

[6]Gage FH. Mammalian neural stem cells[J]. Science，2000, 287(5457):1433-1438.

[7]Louis RP, Katheine RH, Donghui L,etal. Isolation and manipulation of rostral mesencephalic tegmental progenitor cells from rat[J].Cell Transplantation，1995，4:335-342.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.004

R322.83

A

1673-1409(2009)04-R008-03

2009-11-04

刘兵(1973-)，男，湖北钟祥人，讲师，硕士，从事神经生物学和断层解剖学教学与研究工作。