不同剂量的盐酸氨溴索对海水淹溺大鼠肺泡表面活性物质的影响

杨 丽，马兴龙，李春树

(大连医科大学附属第二医院 ICU病房，辽宁 大连 116027)

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是临床常见病，死亡率极高。肺泡表面活性物质(PS)的表达减少是ALI的重要机制之一。海水淹溺性肺损伤是由于海水淹溺后肺泡腔内PS被分解破坏，同时肺泡渗出液的稀释又进一步降低其浓度，提高肺泡表面张力，导致肺损伤。因此，提高PS的含量是治疗ALI的关键之一。

PS主要包括90%的脂质，8%～10%的特异性蛋白。脂质中80%～90%是磷脂，而其中80%是磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱的50%～60%为DSPC，DSPC是降低肺泡表面张力的主要成分。已有研究证明，ALI大鼠的肺泡灌洗液(BALF)中总磷脂(TPL)和磷脂酰胆碱(DSPC)明显低于正常组[1]。

盐酸氨溴索可以促进肺泡表面活性物质的生成，在临床用于治疗多种肺泡表面活性物质减少的疾病。最近文献报道，增加盐酸氨溴索的剂量，每天最多可以达到1 g，对肺泡表面活性物质的增加更有益[2]，但并没有明确的指标证明氨溴索的剂量与肺泡表面活性物质的生成的相关性。虽然在德国有文献报道最大计量可以应用到3 g/d，但大剂量使用氨溴素尚缺乏理论依据。同时大剂量使用氨溴索增加了患者的经济负担，同时疗效并不确定。因此，确定盐酸氨溴索的使用量与肺泡表面活性物质增长相关性对于指导临床用药有着重要的作用。本实验通过检测不同剂量的盐酸氨溴索对海水淹溺大鼠肺泡表面活性物质的影响，尝试明确药物剂量对于肺泡表面活性物质生成的作用。

1 材料和方法

1.1 动物分组与模型制备

健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，由大连医科大学实验动物中心提供。海水取自东经121.6°，北纬 38.5°的黄海海域，盐度3%～3.5%。排除标准：麻醉过量和气管内注射窒息等意外死亡，支气管肺泡灌洗致肺泡破裂，BALF回收率低于80%的大鼠。

将40只雄性SD大鼠随机均分为8组，正常对照组为未经海水淹溺实验的正常大鼠，其余7组按照氨溴索的剂量0、1、4、8、12、16、20 mg/kg，全部在淹溺后4 h采取标本。 动物用硫喷妥钠溶液腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，颈部正中切口，分离气管。气管内注入海水3 mL/kg，建立淹溺性肺水肿大鼠模型。在模型建立的同时按照分组情况给大鼠注射氨溴索。在模型建立4 h后腹腔注射肝素400 U/kg，并处死动物，打开腹腔，从右心室以5 mL/min的速度注射生理盐水15 mL，灌注肺血管，气管插管，行支气管肺泡灌洗，注入预冷的4 ℃生理盐水40 mL/kg来回3次后回收灌洗液，共2次，将收集的支气管灌洗液(BALF)计量，计算回收率，立即4℃,12000 r/min离心10 min， -20℃保存上清。

1.2 BALF中TPL,DSPC的测定

总蛋白标准品(0.5 mg/mL)试剂盒及磷材料品(0.04 mg/mL)试剂盒均由上海生物制品研究所提供。分别用Bartlett法和Mason法测定TPL和DSPC。测定步骤如下：(1) 取2份1 mL样品，分别作为TPL和DSPC样本(样本1和2)，(2)萃取：加入生理盐水1 mL，分别加入1 mL甲醇和1 mL氯仿，(3)震荡3～5 min，静置10 min，取下层(氯仿层),尽可能完整，氮气吹干，标本1待消化测TPL，(4)四氯化锇氧化和过柱；样本2加0.5 mL四氯化锇，室温下反应15 min，氮气吹干并分别用1液和2液过柱，收集洗脱液5 mL，氮气吹干，待消化测DSPC，(5)消化:待消化标本、标准磷(按0.5、1、2、4 μg分4管加样)及空白管各加入0.5 mL 5 mol/L硫酸和0.5 mL双蒸水后置200℃烤箱1 h后取出，冷却后加入3 mL试剂盒中D液，100℃水浴10 min后立即终止反应，(6)测光密度值(D)：分光光度计波长设定为800 nm，灵敏度2挡，(7)计算：磷脂含量(mg/mL)=D样本÷D标准品×标准品磷含量×25，(8)用BALF总量和动物体质量修正测定结果，即TPL或DSPC(mg/kg)=磷脂含量(mg/mL)×BALF 总量(mL)÷动物体质量(kg)。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠淹溺后情况

实验组的7组大鼠淹溺后4 h均能存活。8组间体重及存活系数差异无显著性意义(P>0.1)。

2.2 不同剂量的氨溴索对模型大鼠BALF中TPL和DSPC的影响

8组大鼠BALF中TPL和DSPC的变化见表1。盐酸氨溴索治疗组肺泡灌洗液中的TPL，DSPC的含量随盐酸氨溴索剂量增大而增加，在12 mg/kg时以上指标可与正常对照组(无淹溺组)相似，并且随着氨溴索剂量的增加TPL,DSPC也在增高，与0 mg/kg组比较差异有显著性意义(P<0.05)。

3 讨 论

表1 各组中TPL和DSPC的变化Tab 1 The change in DSPC and TPL by every group

1) 与对照组比较，P<0.05；2) 与0 mg/kg比较，P<0.05

海水淹溺可引起肺毛细血管内皮的损伤。毛细血管内皮的损伤引起血管通透性的增加，形成肺间质和肺泡水肿，是急性肺损伤的一种表现。大量动物实验证实，急性肺损伤的病理基础之一是肺泡表面活性物质的减少[1]。海水淹溺所致的肺泡上皮的损伤同样可以引起肺泡表面活性物质的合成减少或活性降低[3，4]。因此，提高PS表达可以改善肺的顺应性，有效缓解海水淹溺性肺损伤。虽然补充外源性肺泡表面活性物质可能会改善肺的顺应性，但目前批准用于临床的PS制剂价格昂贵，很难在临床推广使用。[5]。

氨溴素具有刺激肺泡II型上皮细胞内细胞器发育，促进PS的生物合成和分泌的作用。同时，氨溴素还可以通过抗氧化，减少炎症介质和细胞因子生成，对ALI有一定的防治作用[6，7]。本实验显示应用氨溴索后与未治疗的对照组(0 mg/kg)相比，盐酸氨溴索治疗组肺泡灌洗液中的TPL，DSPC的含量随盐酸氨溴索剂量增大而增加，在12 mg/kg时以上指标可与正常对照组(无淹溺组)相似，并且随着氨溴索剂量的增加TPL,DSPC也在增高，与0 mg/kg组比较差异有显著性意义(P<0.05)。其升高对急性肺损伤的治疗是否存在有利因素还有待进一步证实。同时，氨溴索12 mg/kg的剂量是否是使肺泡表面活性物质最优化的稳态浓度也是下一步需要关注的问题。

本研究结果表明，使用盐酸氨溴索可提高海水淹溺性大鼠的肺泡表面活性物质，存在量-效关系。随着肺泡表面活性物质的增加，是否存在相应的病理改善和症状的缓解也是作者正在研究的问题[9]。

[1] 许峰，何勇，匡凤梧，等. ALI大鼠肺表面活性物质及肺表面活性物质蛋白的研究[J].重庆医科大学学报，2004，29(2)：131-133.

[2] 刘辉，王国军，丁正年. 外源性肺泡表面活性物质对ALI治疗效果及量效关系的研究[J]. 南京医科大学学报，自然科学版，2005，25(3)：176-179.

[3] 董文度，赵增荣，张敏华，等.兔海水淹溺肺水肿时肺损伤及其机理研究[J].中华航海医学杂志,1998,5(1)：16-19.

[4] Su X,Wang L,Song Y.Inhibition of inflammatory responses by ambroxol,a mucolytic agent,in a murine model of acute lung injury induced by lipopolysaccharide Intensive[J].Care Med,2004,30(1):133-140.

[5] Jain D,Dodia C,Sandra R,et al.SP-A is necessary for increased clearance of alveolar DPPC with hyperventilation or secretagogues[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,284(15):759-765.

[6] Lee CS,Jang YY,Song JS,et al.Ambroxol inhibits peroxynitrite-induced damage of a phal-antiproteinase and free radical production in activated phagocytic cells[J].Pharmacol Toxicol,2002,91(3):140-149.

[7] Zhao SP,Guo QL,Ai YH,et al.Prophylatic effect of ambroxol on acute hydrochloric acid asp iration-induced lung injury[J].Chin Critical Care Med,2005,17(6):364-366.

[8] Calfee CS,Matthay MA.Nonventilatory treatments for acute lung injury and ARDS[J].Chest,2007,131(3):913-920.

[9] Otlonello L,Arduino N,Bertolotto M,et al. In vitro inhibition of human nutrophil histotoxicity by ambroxol:evidence for a multistep mechanism[J].Br J Pharmacol,2003,140:736-742.