当归注射液关元穴给药拮抗雷公藤多苷所致生殖系统毒性的实验研究

万 晶,田 舸,田 燕,高 萌,艾 群，李 镇,梅 林

(1.大连医科大学附属第二医院 药剂科，辽宁 大连116027;2.大连医科大学 药学院，辽宁 大连116044;3.大连医科大学附属第二医院 中医科，辽宁 大连116027)

长期临床实践和药理、药效实验研究表明[1]，雷公藤多苷(Glycosides of Tripterygium wilfordii Hook.f.GTW)作用方式独特，具有类皮质激素的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等作用，对风湿性疾病及肾脏疾病等疗效显著。但其常见的消化系统和生殖系统的毒副作用又一直困扰着医药工作者[2]。因此，如何降低GTW毒性甚至增强其疗效逐渐成为学者们研究的焦点。许多学者从中药方剂配伍入手，通过动物药理实验，为GTW减毒增效研究打开了新的局面[3]。具有逐瘀、活血、调经等作用的当归，中医称之为“女科之圣药”，专治月经不调，闭经，痛经等妇科疾病，是既能保胎，又能抗氧化及延缓衰老的女性良药[4]。作者认为，在正确选择药物的前提下，药物的应用方式同样非常重要，不同的给药方式是否均能拮抗雷公藤多苷所致生殖系统的毒性尚未见报道。本研究进行了当归注射液(Angelica Injection,AI)口服给药与元穴给药对比实验，报告如下。

1 材料和方法

1.1 材 料

酶标仪(Thermo Electron Corporation,Type：354)， 光学显微镜(BX41，日本奥林巴斯公司)，Sartorius BS 110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，雷公藤多苷片(浙江普洛康裕天然药物有限公司，090504 10 mg/片)， 瑞氏染色剂(北京中西远大科技有限公司)，吉姆萨染色剂(北京华美生科生物技术有限公司)， 小鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒(Adlitteram Diagnostic Laboratories，Inc.)，AI注射液(36.2 mg/mL)：大连医科大学药剂学教研室提供，其他试剂为市售分析纯。实验动物为健康成熟8周龄雌性小鼠24只，体重25～28 g，由大连医科大学动物实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组:实验分为正常组、模型组(制备GTW毒性作用)、AI穴位给药组和AI口服给药组。全部小鼠每天早上9点进行阴道脱落细胞涂片检查，连续10 d。具体操作:取生理盐水3～5滴，滴入小鼠阴道，反复抽吸3次，取阴道分泌物1滴均匀涂于载玻片上，自然晾干；用95%甲醇液固定5 min,自然晾干；用瑞氏染色液染色5～8 min，清水冲洗；再用吉姆萨染色液染色5～8 min，冲洗，自然晾干；置于光学显微镜×100下观察小鼠动情周期变化情况[5]。筛选出有正常动情周期者为受试动物，随机分组，每组6只。

1.2.2 给药方法及剂量:(1)正常组:按0.1 mL/10 g体重灌服生理盐水，1次/d，连续给药8 d；(2) 模型组:将1000 mg雷公藤多苷片溶于250 mL生理盐水配制为4 mg/ mL溶液，按40 mg/kg体重灌胃GTW[6]， 1次/d，连续给药8 d[7]；(3)AI穴位给药组:按(2)项下口服GTW的同时，0.1 mL /10 g体重关元穴注射AI ，1次/d，连续给药8 d；(4)AI口服给药组:按(2)项下口服GTW的同时，0.1 mL/10 g体重灌胃AI，1次/d，连续给药8 d。

1.2.3 标本的采集与处理:(1) 血样的采集与处理:处死小鼠前称取体重，采用眼球摘除取血法，全血于室温下放置1 h，再以2000 r/min离心10 min，分离血清，采用酶联接免疫吸附法测定血清E2含量[8]。(2) 组织标本的采集与处理:称取小鼠体重，取血处死后将卵巢、子宫分别取出，剥离周围附着组织，在电子分析天平上称取湿重，按以下公式计算卵巢指数与子宫指数[9]。

卵巢指数=卵巢湿重(mg)/体重(g)×100%

子宫指数=子宫湿重(mg)/体重(g)×100%

1.2.4 观察指标:行为学(饮食、皮毛光泽、精神状态、粪便)；体重；血清学；动情周期；卵巢指数；子宫指数。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 行为学观察

模型组与正常组比较:小鼠摄食量、饮水量减少，大便量少且较软，毛少且光泽干枯，活动频度减少，精神较差；AI穴位给药组小鼠精神及活动度较好，其一般情况与正常组无明显区别；AI口服给药组小鼠较之正常组小鼠大便较稀，毛少光泽，活动频度较少、精神较差，但进食、饮水情况基本相同，结果见表1。

2.2 体重变化

各组体重变化的比较见表2，由表中数据可以看出，模型组与正常组比较体重明显下降，体重测量值差异具有显著性意义(P>0.05)。AI穴位给药组与模型组相比，小鼠体重测量值差异具有显著性意义(P<0.05)；AI口服给药组与模型组相比，小鼠体重测量值差异无显著性意义(P>0.05)。AI穴位给药可抑制GTW造成的小鼠体重下降，而AI口服给药则不能抑制。

表1 各组小鼠的行为学比较Tab 1 Comparision of the mice behavior in each group

表2 各组小鼠实验期间的体重变化Tab 2 Changes of the mice weight in each group during experiment (g)

1)与正常组相比，P<0.05; 2)与模型组相比，P<0.05

2.3 动情周期观察

本实验采用的小鼠正常动情周期为4～7 d，包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期。动情前期阴道涂片中有核上皮细胞占优势，它们有的是单个的，有的呈片状，并有少量白细胞，见图1a；动情期涂片中有很多无核的角化鳞状细胞，细胞大而扁平，边缘不整齐，视野中看不到或很少白细胞与上皮细胞，见图1b；动情后期涂片中角化上皮细胞减少，出现许多白细胞及有核上皮细胞，见图1c；动情间期小鼠阴道粘膜薄，白细胞从粘膜内游离出来，使阴道涂片中几乎全部为白细胞，见图1d；灌服雷公藤多苷8 d后，可造成小鼠动情周期的紊乱，见表3。这主要表现为连续数天阴道分泌物中出现大量白细胞，偶有较小的有核扁平上皮细胞，见图1e。通过对小鼠动情周期的观察可确定，灌服雷公藤多苷的同时AI口服给药只可恢复部分小鼠的动情周期。灌服雷公藤多苷的同时AI关元穴给药可使大部分小鼠动情周期恢复。

表3 实验后各组小鼠动情周期的状态

2.4 实验小鼠雌激素E2的比较

2.4.1 标准曲线的制备:标准曲线绘制结果见表4、图2。

表4 雌二醇(E2)标准品测定表Tab 4 The results of estradiol(E2) standard curve

图1 小鼠动情周期的阴道涂片观察 (×100)

图2 雌激素E2的标准曲线图Fig 2 The standard curve of extrogen E2

2.4.2 各组小鼠雌激素E2的比较:模型组与正常组相比，E2值明显下降，差异具有显著性意义(P<0.05)。AI穴位给药组与模型组相比，E2值明显上升，差异具有显著性意义(P<0.05)；AI口服组与模型组相比，E2值虽有上升，但差异无显著性意义(P>0.05)。由此可以看出，AI关元穴给药后，可使卵巢早衰的小鼠E2值恢复正常，而AI口服给药则不能达到相同的疗效(表5)。

2.5 实验小鼠子宫指数的比较

模型组与正常组相比，子宫指数测量值差异具有显著性意义(P<0.05)。AI穴位给药组与模型组相比，子宫指数测量值差异具有显著性意义(P<0.05)；AI口服给药组与模型组相比，子宫指数测量值差异无显著性意义(P>0.05)。AI关元穴给药，可使卵巢早衰的小鼠子宫指数值恢复正常，而AI口服给药不能达到相同的疗效(表6)。

表5各组小鼠雌激素E2的比较

Tab 5 Comparision of the mice extrogen E2 level in each group

组别nE2浓度(pg/mL)正常组6617．04±29．70模型组6298．27±41．531)AI口服给药组6333．80±50．33AI穴位给药组6562．30±85．962)

1)与正常组相比，P<0.05;2)与模型组相比，P<0.05

表6 各组小鼠子宫指数的比较Tab 6 Comparision of the mice uterus index in each group

1)与正常组相比，P<0.05;2)与模型组相比，P<0.05

2.6 实验小鼠卵巢指数的比较

模型组与正常组相比，卵巢指数测量值差异具有显著性意义(P<0.05)。AI穴位给药组与模型组相比，卵巢指数测量值差异具有显著性意义(P<0.05)；AI口服给药组与模型组相比，卵巢指数测量值差异无显著性意义(P>0.05)。AI关元穴给药，可使卵巢早衰的小鼠卵巢指数值恢复正常，而AI口服给药不能达到相同的疗效(表7)。

表7 各组小鼠卵巢指数的比较Tab 7 Comparision of the mice ovarian index in each group

1)与正常组相比，P<0.05;2)与模型对照组相比，P<0.05

3 讨 论

雷公藤多苷具有显著的抗炎、免疫调节作用。临床上用于风湿热阏，毒邪阻滞所致的类风湿性关节炎，肾病综合症，白塞氏三联症，麻风反应，自身免疫性肝炎等疾病。但是雷公藤制剂在起到治疗作用的同时，对人体毒副作用较明显，比如有恶心、食欲减退，白细胞、血小板减少，月经紊乱，精子减少等症状。其中最主要的是对生殖系统的毒性，年轻女性短期服用(1～3个月)可至经期紊乱，长期服用(3～5年)，可致完全闭经。

当归味甘微辛，气香液浓，性温，归心、肝、脾三经，为生血活血之主药，加之又能宣通气分，使气血各有所归，故名之曰当归。《药品化义》云：“凡药体性，分根升，梢降，中守，此独一物而全备。头补血上行，身养血守中，梢破血下行，全活血运行周身。”因此，当归为妇女调经、胎前产后之要药，所以临床上广泛应用。

“穴位注射”又称“水针疗法”， 是中西医结合的治疗方法。它形成于50年代初期，首先应用于封闭疗法，后被临床广泛应用。“穴位注射”是根据所患疾病，按照穴位的治疗作用和药物的药理作用，选用相应的腧穴和药物，操作时，将注射针刺入穴位，作提插手法，使其得气，抽吸无回血后再将药液缓缓注入穴位，激发经络与穴位，从而起到穴位、针刺、药物三结合，以充分发挥腧穴和药物对疾病的综合作用，从而达到治疗疾病目的的一种方法。经临床观察效果颇佳[10,11]。

本实验比较了AI关元穴给药和AI口服给药对GTW所致小鼠生殖系统毒性的拮抗作用，结果表明，(1)当归这个被中医称之为“女科之圣药”的传统中药在拮抗雷公藤多苷所致生殖系统的毒性方面是值得考虑的；(2)等剂量用药条件下，穴位注射较口服途径给药有效，再次验证水针疗法是一种很有前途的治疗方法，同时提示GTW口服给药所致小鼠生殖系统毒性的副作用是可以通过联合用药手段拮抗的。

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