不明原因早期自然流产患者绒毛和蜕膜组织中Bcl-2和Fas蛋白的表达*

刘 敏，石运芝，王黎明

(1. 青岛大学医学院, 山东 青岛 266021； 2.泰山医学院附属泰安医院妇科, 山东 泰安 271000；3.泰山医学院基础医学部, 山东 泰安 271000； 4. 青岛大学医学院附属医院妇科， 山东 青岛 266011)

早期自然流产是指在娠妊12周之前非故意终止的宫内妊娠，是临床常见的病理妊娠之一。在排除母方内分泌功能失调、子宫病变、病原微生物感染、滥用药物、父方染色体、精液异常等致病因素的情况下，仍有60%～70%妊娠妇女发生流产，称之为不明原因早期自然流产(early unexplained spontaneous abortion)。国内外研究结果显示，不明原因早期自然流产的机制十分复杂，可能与细胞凋亡相关基因的表达异常有关[1-4]。本研究拟采用免疫组织化学SABC法，检测抑制凋亡的Bcl-2蛋白和促进凋亡的Fas蛋白在早期正常妊娠和自然流产的绒毛及蜕膜组织中的分布和变化规律，以期进一步明确细胞凋亡在早期自然流产中的病理机制，并为临床治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究对象与分组

收集2009年11月～2009年12月，在泰安市中心医院妇产科门诊要求终止早孕的15例妇女，做为正常妊娠组。自然流产组共20例，为首次不明原因自然流产者。两组孕妇年龄20～35岁，身体健康，月经规律(月经周期28～30 d)，停经5～9周，3个月内未使用任何激素类药物，宫颈、阴道无急性及慢性炎症，未放置宫内节育器，无异常孕育史。

1.2 主要试剂

兔抗人Bcl-2和Fas抗体及辅助试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

两组均在确诊后，负压吸宫，取其胎盘绒毛和蜕膜组织。PBS冲洗后，投入4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、石蜡包埋，连续切片，切片厚度为6 μm。切片常规脱蜡，梯度酒精至水，用SABC法进行免疫组织化学染色：①3% H2O2中室温作用10 min，蒸馏水洗；②微波抗原修复2次；③5%BSA封闭液，室温20 min；④分别滴加兔抗人Bcl-2(1∶200)和兔抗人Fas(1∶200)，37℃孵育2 h；⑤生物素标记的IgG (1∶200), 室温1 h，缓冲液冲洗；⑥SABC复合物(1∶200)，室温1 h；⑦DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS替代一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定及分析

每个标本随机选取6张切片，光学显微镜下，每张切片随机观察3个视野，阳性部位呈棕黄色。并将图像输入Image Pro Plus图像分析系统(泰山医学院基础研究所)，分别测得各实验组胎盘绒毛和蜕膜组织中阳性细胞的平均光密度(OD值)。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 绒毛和蜕膜组织中Bcl-2免疫组化染色结果

抑制凋亡的Bcl-2蛋白主要分布于绒毛合体滋养层、细胞滋养层和蜕膜细胞的胞质内(图1、2、3)，且在正常妊娠组的水平显著高于自然流产组(P﹤0.05)。Bcl-2蛋白在蜕膜细胞中的水平明显低于其在滋养层的水平(见表1)。

2.2 绒毛和蜕膜组织中Fas免疫组化染色结果

促进凋亡的Fas蛋白主要分布于绒毛合体滋养层、细胞滋养层和蜕膜细胞的胞质内(图4、5、6)，且在自然流产组的水平显著高于正常妊娠组(P﹤0.05)。Fas蛋白在蜕膜细胞中的水平明显高于其在滋养层的水平(见表1)。

表1 绒毛和蜕膜组织中Bcl-2和Fas免疫反应物的平均光密度

注： 与正常妊娠组相比，*P﹤0.05

图1 Bcl-2蛋白在正常妊娠组绒毛组织中的表达 ×400

图2 Bcl-2蛋白在自然流产组绒毛组织中的表达 ×200

图3 Bcl-2蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中的表达 ×200

图4 Fas蛋白在自然流产组绒毛组织中的表达 ×200

图5 Fas蛋白在自然流产组蜕膜组织中的表达 ×200

图6 Fas蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中的表达 ×200

3 讨 论

细胞凋亡(apoptosis)是指一种受细胞内外因素调控的细胞自杀性死亡方式，且死亡细胞从组织中清除的过程不伴随炎症反应。凋亡调控相关基因表达失衡可能是导致各种病理妊娠发生的重要原因之一。如在感染引起的早产、妊高征及IUGR等妊娠并发症中都证实了细胞凋亡的作用；有研究证明药物米非司酮的抗早孕作用也是通过诱导和促进蜕膜及绒毛细胞凋亡来实现的[5-9]。

Bcl-2蛋白主要分布于线粒体内膜、内质网及核膜，可通过与细胞中另一被称作Bax的蛋白相结合或通过抗氧化作用或抑制氧化自由基的产生而阻止或减少由各种刺激引起的细胞凋亡[10，11]。本研究结果显示:正常早孕阶段绒毛合体滋养层、细胞滋养层和蜕膜细胞中均有抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达。这与Kim等[12]报道的Bcl-2蛋白只表达于合体滋养层细胞的结论以及国内滕振娟等[13]和张月莲等[14]报道的Bcl-2蛋白主要分布在细胞滋养层细胞的细胞质中,合体滋养层细胞中不表达的结论不一致。我们认为，国内外研究结果的差异可能与取材时间和具体操作程序的不同有关。正常早孕阶段Bcl-2蛋白的表达可能在维持合体滋养层、细胞滋养层和蜕膜细胞的数量上发挥重要作用，从而保障早孕绒毛的发生、发育、胎盘形成和为孕卵生长提供充足的营养。不明原因早期自然流产组绒毛滋养层和蜕膜细胞中Bcl-2蛋白的表达下调，导致大量细胞凋亡，继而发生自然流产，这与KoKawa等[15]的研究相一致性。

Fas抗原又称Apo-1CD95,属于肿瘤坏死因子(TNF) /神经生长因子(CNGF)受体超家族成员,是I型跨膜蛋白。Fas通过与其天然配体Fas-L结合，可诱导表达Fas的细胞凋亡。本研究结果还显示，促进凋亡的Fas蛋白在正常早孕阶段绒毛合体滋养层、细胞滋养层和蜕膜细胞中低表达，在不明原因早期自然流产组高表达。这与丁峰等报道的自然流产蜕膜细胞Fas mRNA和蛋白表达的增加相一致[28]。Hammer等的实验结果曾显示绒毛滋养细胞表达FasL,通过诱导表达Fas的母体蜕膜白细胞凋亡,形成母胎免疫豁免区,使胚胎免受母体免疫细胞损伤[16]。不明原因早期自然流产过程中，可能由于Fas蛋白在滋养层和蜕膜细胞中表达升高，通过与Fas-L结合引起细胞凋亡增加，使绒毛生长受阻,蜕膜变性坏死，从而阻碍了人类孕卵的发育, 继而发生自然流产。

综上所述，正常早孕阶段存在细胞凋亡，对妊娠的顺利进行有重要作用，但是如果凋亡调控相关基因表达失衡则会导致自然流产的发生。如果能够明确引起异常凋亡的因素和机制,进而人为地控制这些因素或阻断其作用途径，就有可能达到对自然流产的预防和治疗作用。

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