新疆地区绵羊和肉鸡不同组织兽药残留及消除规律研究

卞欣欣,董志远,郭 璇,贾新建,邵 伟,景 炜,蒲雪松,余 雄

(1.新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所)

随着畜牧业的快速发展,大量药物在生产中被广泛的使用。食品动物在使用兽药后,兽药的原形及其代谢物等有可能蓄积或残存在动物的细胞、组织或器官内,或进入泌乳动物的乳、或产蛋家禽的蛋中,药物残留危害着人类的健康。随着人们生活水平的提高,近年来畜产品中药物残留问题日益受到重视。但是到目前为止,国内外关于抗生素和驱虫药在绵羊和肉鸡各组织中残留量的研究较少,难以满足畜牧生产的需要。新疆地区羊肉和鸡肉生产过程中兽药的使用和残留情况的研究较少,因此本试验在这方面进行了研究,为畜禽生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物 哈萨克羊15只,年龄9～10月龄,体重40～45 kg,没有使用过任何抗生素和驱虫类药物。新疆泰昆集团阜康500商品鸡场提供的42日龄AA肉鸡10只。

1.2 仪器与试剂 Agilent1100系列高效液相色谱仪及化学工作站,包括自动进样器、荧光检测器、DAD检测器、紫外检测器、视差检测器、恒温柱温箱、真空在线脱气装置,550型酶标仪(配备450 nm滤光片),氮吹仪(N-EVAPTM-111,美国Organomation Associates公司),离心机(TDL-40B,上海安亭科学仪器厂),Millipore超纯水制备器,旋涡混合仪,振荡混合仪,恒温水浴箱,超声波清洗机,分析天平(感量0.000 01 g),天平(感量0.01 g)。乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯为色谱纯;二乙胺为分析纯。标准品:阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、盐酸左旋咪唑、吡喹酮由美国Sigma公司提供,含量均大于99%。试剂盒由北京望尔生物技术有限公司生产。

1.3 药物与设计

1.3.1 绵羊的投药方法及样品采集 试验在新疆农业大学动物试验场进行,为期40 d。由于各种药物的休药期不同,因此将15只羊随机分为3组,每组5只,且组间体重差异不显著(P＞0.05)。试验绵羊的用药程序如表1所示,投药后5、15、25 d各随机选择1组宰杀,取其肌肉(包括臀肌、半腱肌、背最长肌)、肝脏和肾脏组织,-20℃冰箱中保存待测。对所采集的样品测定每种药物的残留量,并研究其在绵羊组织中的残留规律。

表1 绵羊的投药程序

1.3.2 肉鸡样品的采集 实验中AA肉鸡的投药程序依照新疆地区商品肉鸡的标准进行,在第42天(出栏)随机抽取10只,宰杀,取其胸肌、腿肌、心脏、肝脏和肾脏组织,-20℃冰箱中保存待测。强力霉素在鸡10～13、16～19日龄时投放,剂量4 mg/kg;硫酸新霉素在鸡16～19、31～33日龄时投放,剂量16 mg/kg。由于以上2种药物在肉鸡的饲养过程中使用的频率特别高,因此,在出栏时主要针对这2种药物的残留做了检测。

1.4 样品处理 吡喹酮的样品处理按照农业部958号公告-11-2007的步骤操作;阿苯达唑的样品处理按照农业部958号公告-9-2007的步骤操作;左旋咪唑的样品处理按照JAP-175左旋咪唑检测方法处理;绵羊组织中青霉素钠、硫酸链霉素、头孢噻呋钠、伊维菌素和肉鸡组织中强力霉素、新霉素的样品处理与结果计算按试剂盒说明的操作程序进行。

1.5 色谱分析条件 吡喹酮色谱柱:XTerra C18柱(250 mm ×4.6 mm,4.5μ m),以乙腈、水为流动相,梯度洗脱程序见表2,流速0.9 mL/min,柱温28℃,进样量10 μ L,紫外检测器检测,检测波长214 nm。

表2 流动相梯度洗脱程序

左旋咪唑色谱柱:XTerra C18柱(250 mm×4.6 mm,4.5 μ m),以乙腈∶磷酸二氢钾—二乙胺缓冲液(pH7.5)(3∶7)的混合溶液为流动相,流速 1.0 mL/min,柱温 35℃,进样量 20 μ L,DAD 检测器检测,检测波长 250 nm。

阿苯达唑色谱柱:XTerra C18柱(250 mm×4.6 mm,4.5 μ m);流动相 :A 相:乙腈,B 相:水 ,C 相 :10%冰乙酸;梯度洗脱程序见表3,流速1.0 mL/min,柱温25℃,进样量 20 μ L,DAD检测器检测,检测波长292 nm。

表3 流动相梯度洗脱程序

1.6 数据统计方法 实验中数据以平均值±标准差表示,运用SPSS 13.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 绵羊组织中药物残留情况

2.1.1 抗生素类药物残留检测结果 表4表明,青霉素钠在肾脏组织中的残留量极显著(P＜0.01)地高于肝脏和肌肉组织;肝脏与肌肉中青霉素钠的残留量未表现出显著差异(P＞0.05);结果显示,肾脏＞肝脏＞背最长肌＞臀肌＞半腱肌。头孢噻呋钠在绵羊各组织的残留量均未表现出显著差异(P＞0.05),并且残留量较低,在3μ g/kg左右。

表4 停药5 d青霉素钠、头孢噻呋钠在绵羊组织的残留量(n=5) μ g/kg

表5表明,停药10 d时硫酸链霉素在肝脏和肾脏中的残留量与肌肉组织相比差异极显著(P＜0.01),肾脏中残留量最高,达242 μ g/kg,各肌肉组织间差异不显著(P＞0.05);停药20 d时硫酸链霉素在肝脏和肾脏中的残留量与肌肉组织相比差异极显著(P＜0.01),肝脏和肾脏中硫酸链霉素的残留量是肌肉组织的6.5倍,臀肌、半腱肌和背最长肌中硫酸链霉素的残留量差异不显著(P＞0.05);停药30 d时,硫酸链霉素在肝脏和肾脏中的残留量与肌肉组织相比差异极显著(P＜0.01),肝脏中残留量最高,达到 219μ g/kg,各肌肉组织间差异不显著(P＞0.05)。

在停药10 d时,臀肌、半腱肌和背最长肌中硫酸链霉素残留量与20 d相比差异极显著(P＜0.01),停药10 d时硫酸链霉素在各肌肉组织内的残留量是停药20 d时的4倍左右,不过这三个部位在20 d和30 d未表现出显著差异(P＞0.05);第10 d、20 d和30 d肝脏中硫酸链霉素残留量差异不显著(P＞0.05);比较硫酸链霉素在肾脏中的残留量,在10 d和20 d差异不显著(P＞0.05),30 d残留量比前两批下降了20%,与前两批比较差异极显著(P＜0.01)。

表5 硫酸链霉素在绵羊组织的检测结果(n=5) μ g/kg

2.1.2 抗寄生虫类药物残留检测结果 停药17 d时,伊维菌素在绵羊不同组织的平均残留量分别是:臀肌 2μ g/kg 、半腱肌 1μ g/kg、肾脏 3.2μ g/kg,肝脏和背最长肌未检出;停药27 d时的样品未检出。左旋咪唑、阿苯达唑和吡喹酮均未检出。

2.2 肉鸡组织中兽药残留情况 表6表明,肉鸡(42 d)出栏时,新霉素在胸肌、腿肌和心脏中的残留量与肝脏、肾脏比,差异极显著(P＜0.01),胸肌和腿肌中新霉素的残留量最高,肝脏和肾脏最低,残留量仅为肌肉中的四分之一;强力霉素在肾脏中的残留量与其他组织相比差异极显著(P＜0.01),肾脏中的残留量比肌肉、心脏和肝脏高10倍左右。

表6 出栏肉鸡不同组织中药物的残留量(n=10) μ g/kg

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 停药5 d时检测绵羊各组织中青霉素钠的残留情况,肾脏内的残留量最高,达到 40.70μ g/kg,是肝脏的4倍,肌肉中的残留量最低,仅为肾脏残留量的六分之一。研究结果表明,在肝脏和肌肉组织中的残留量较低,说明青霉素钠在这两种组织中的代谢速率比较快。青霉素钠在肾脏中含量较高,在肾功能正常的情况下,50%～75%自肾脏排出;小部分在肝脏内代谢[1]。本试验肾脏中青霉素钠的残留量最高,这与前人研究结果相似。目前,国内尚无青霉素钠在绵羊组织残留量的报道,只有少数几种青霉素在牛奶中残留检测的报道[2]。中国和欧共体(EEC)规定食用组织中青霉素的最高残留限量(MRL)标准为50μ g/kg,本试验在停药5 d时,青霉素钠在绵羊各组织中的残留量低于标准残留限量。

3.1.2 头孢噻呋钠在绵羊停药5 d时检测,各组织内残留量均极低,约3μ g/kg,在体内分布量依次为肾脏＞背最长肌＞臀肌＞肝脏＞半腱肌。头孢噻呋钠在动物体内的残留量非常低,FDA(美国药品食品管理局)已确定其宰前停药期与牛奶废弃期为0 d[3]。由中国和欧共体(EEC)规定的食用组织中头孢噻呋的最高残留限量(MRL)标准可知,停药5 d时,头孢噻呋钠在绵羊各组织的残留量未超过标准残留限量。

3.1.3 中华人民共和国兽药典规定硫酸链霉素在绵羊上使用的休药期是18 d,因此,分别在停药10、20、30 d各检测一批样品,结果显示,在10 d硫酸链霉素在各组织中残留量最高,肝脏和肾脏的残留量比肌肉组织的高一倍;停药20 d,与10 d比较,肌肉组织中硫酸链霉素的残留量减少了80%左右,但是肝脏和肾脏中残留量变化不明显;停药30 d硫酸链霉素在绵羊肌肉组织中的残留量较20 d下降了30%左右,肝脏和肾脏的残留量下降了10%左右。说明硫酸链霉素在绵羊肌肉组织中的代谢速率在前20 d较快,20 d后由于残留量较少,代谢速率降低。研究结果表明,硫酸链霉素在绵羊的肝脏和肾脏中代谢时间长,残留量高;肌肉组织中代谢快,残留量低。注射部位和肾脏中链霉素残留滞留期较长,其他可食部分残留量低[1]。欧盟对动物性食品中链霉素的最大残留限量做了明确的规定[4],本试验检测的3批样品均未达到标准残留限量。

3.1.4 伊维菌素在停药17 d检测结果显示,肾脏残留量最高3.2 μ g/kg,肾脏＞臀肌＞半腱肌,肝脏和背最长肌未检出。停药27 d的样品未检出。放射标记伊维菌素代谢研究表明,肝脏和脂肪是伊维菌素进行生物转化的两个主要场所,同时也是药物分布浓度最高,消除速度最为缓慢的两种组织[5]。另有研究表明,羊皮下注射或内服0.3 mg/kg伊维菌素后,在体内残留较多的组织包括肝脏、脂肪、骨骼和胆汁[6]。本研究表明,在休药期内,伊维菌素在绵羊各组织中的残留量低于欧共体(EEC)规定的标准残留限量。

3.1.5 阿苯达唑在停药后7 d未检出。羊残留消除研究表明,用药后数日内组织中的代谢物浓度变化很大,羊一次内服15 mg/kg阿苯达唑后,肝脏中残留量最高,休药1 d,肝脏中总残留量为16 mg/kg,休药4 d和 20 d,残留量降至 700μ g/kg和 170μ g/kg,只是组织中的残留量较低[1]。

3.1.6 左旋咪唑在停药后6 d,未检出。研究表明,左旋咪唑口服后迅速被机体吸收,排泄分解迅速[7]。左旋咪唑及其代谢产物可自尿、粪便及呼吸道排出,自尿中排出的原形药物约为服入总量的16%。给羊肌肉注射左旋咪唑10 mg/kg,10 min后即可自尿中测出,2 h后尿中含量最高,4 h后已全部消失[8]。

3.1.7 吡喹酮在停药后17、27和37 d各检测1批,均未检出。

3.1.8 中国和欧共体(EEC)规定食用组织中新霉素的最高残留限量(MRL)标准为,肌肉和肝脏 500 μ g/kg、肾脏1 000 μ g/kg。本试验中,新霉素在肉鸡胸肌和腿肌中残留量最高,达5.7 μ g/kg,肝脏和肾脏最低,残留量仅为肌肉中的四分之一。依据标准可知,新霉素在肉鸡各组织中的残留量低于标准残留限量。

3.1.9 强力霉素在肾脏中的残留量最高,达81.97 μ g/kg,比肌肉、心脏和肝脏高10倍多。强力霉素内服吸收良好,生物利用度达90%以上;体内分布广泛,以肾脏和肝脏中浓度最高,骨和牙质次之[9]。本试验中强力霉素在各组织中的残留量均低于中国和欧共体(EEC)规定的标准残留限量。

3.2 结论

3.2.1 绵羊肌肉注射青霉素钠停药5 d后检测结果显示,青霉素钠在绵羊肾脏中的残留量最高,是肝脏的4倍,肌肉组织中的残留量最低。

3.2.2 绵羊肌肉注射头孢噻呋钠停药5 d时在各组织中的残留量均极低。

3.2.3 绵羊肌肉注射硫酸链霉素,分别在停药10、20和30 d后检测。结果表明,硫酸链霉素在绵羊的肝脏和肾脏中代谢时间长,残留量高;肌肉组织中代谢快,残留量低。

3.2.4 绵羊内服伊维菌素,停药17 d时检测,以肾脏中的残留量最高,肝脏和肌肉组织很少。

3.2.5 绵羊内服阿苯达唑,停药7 d检测,未检出;绵羊内服左旋咪唑,停药6 d检测,未检出;绵羊内服吡喹酮,停药17、27和37 d时检测,均未检出。

3.2.6 肉鸡42 d(出栏)时,新霉素在肉鸡的胸肌和腿肌中残留量最高,在肝脏和肾脏中的残留量仅为肌肉组织的四分之一。

3.2.7 肉鸡42 d(出栏)时,强力霉素在肾脏中的残留量最高,是肌肉组织、心脏和肝脏残留量的10倍多。

3.2.8 本试验中各种药物的残留量均低于中国和欧共体(EEC)规定的标准残留限量。

[1]庞国芳 .农药兽药残留现代分析技术[M].北京:中国科学出版社,2007.

[2]刘维华,刘辛贇.银川地区部分牛奶青霉素残留情况的调查[J].中国动物检疫,2004,21(5):34-35.

[3]Olson S C,Beconi-Barker M G,Smith E B,et al.In vitro metabolism of ceftiofur in bovine tissues[J].J Vet Pharmacol Ther,1998,21(2):112-120.

[4]EMEA.Committee for Veterinary Medicinal Products(CVMP)[R].1998.

[5]M ckellar Q A ,Benchaoui H A.Avermectins and milbermycins[J].Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics,1996,19:331-351.

[6]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量[S].2002.

[7]林居纯,张福华.复方左旋咪唑在山羊体内的药代动力学[J].四川农业大学学报,2003(1):47-49.

[8]尹荣兰.左旋咪唑研究进展[J].中国兽医杂志.2005,41(5):45-46.

[9]王旗,蒋激扬,谢蜀生.高效液相色谱法测定血清中多西环素[J].中国临床药理学杂志,2002,18(3):224-226.