新型钛合金及其生物活性涂层材料慢性毒性实验研究

西安红十字会医院骨关节科(西安 710054)

宋 伟 王坤正* 姚建锋 张育民 秦四清 于振涛# 王传文☆

*西安交通大学医学院第二附属医院骨一科

#西北有色金属研究院

☆河南省商丘市第一人民医院

随着创伤骨折及关节疾病的日益增多,矫形外科技术以及生物材料工程也飞速发展,其中开发新型医用生物材料日益重要。由西北有色金属研究院研究开发的新型钛合金 TLM及其复相二氧化钛生物活性涂层材料,其用途主要是制作骨科内固定器材、关节假体等体内植入材料,将应用于骨外科、口腔外科等临床领域。为了评价新型材料体内植入慢性毒性反应,本实验将受检材料制备成特定形状后植入实验动物肌肉内,通过观察多项指标并与对照材料对比后综合研究慢性毒性反应,为新材料的进一步实验研究及临床应用提供动物实验证据。

材料与方法

1 实验材料 基材组:新型 TLM钛合金,主要成分为钛、锆、锡、钼、铌及钽;涂层组:带有二氧化钛复相涂层的新型 TLM钛合金;对照组:Ti-6Al-4V合金。以上材料均为西北有色金属研究院提供。

2 实验动物 实验动物为 SD大鼠,购自西安交通大学医学院实验动物中心(动物合格证号:医动字08-005),均为健康、已断乳并且未实施过其他任何实验的 6周龄动物,体重要求范围为 180～ 220g。按照随机原则将大鼠分为基材组、涂层组及对照组。每组动物数为 50只,雌雄各半,雌性均未孕育。按照 1992年中华人民共和国卫生部发布的《医学实验动物标准》的要求饲养。

3 实验样品的准备[1]所有实验样品均均制备成光滑圆柱体(直径=1.0mm,长度=5.0mm),采用煮沸法灭菌后 24h内供动物实验植入使用。

4 植入方法及术后处理[1]将动物以戊巴比妥钠按 40mg/kg的剂量采用腹腔注射麻醉,将动物固定于动物手术台上,消毒后将受试样品圆柱体 1枚植入左侧股部肌肉内,术中注意无菌操作,术后应用抗生素。

5 实验观察 术后每天观察动物切口有无红肿渗出、有无植入样品脱落、呼吸、活动、排泄物性状、进食进水量等情况,观察时间为 6个月。

6 统计学处理 本组测量各动物总增重数值及肝、肾、脾及脑组织重量计算脏器指数后以 SPSS10.0统计软件处理,以 P＜0.05为有显著性差异,P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 一般观察 见表 1。手术后第 1、2天,分别有对照组 3只、基材组 1只、涂层组 2只大鼠出现不同程度倦怠、毛发凌乱、活动不积极,3d后症状自行消失。所有受试动物均未出现切口红肿等感染症状、样品脱落或死亡等情况。根据 ASTM有关材料生物相容性评价中动物染毒后一般毒性观察指标判断新型 TLM合金组及其二氧化钛涂层组均属于正常级别,未显示出中毒表现。实验结束时,各组动物均活跃健康,处死后解剖见皮肤、软组织、淋巴结、心、肝、肺、胰、肾、脑及消化道等各主要脏器大小、形态、色泽、质感正常,无肿瘤组织生长,材料植入部位未见囊性组织或肿瘤生长。

2 雌雄大鼠增重、肝、脾、肾脑等变量比较 见表2～4。 三组两两之间无显著性差异(P＞ 0.05)。

表1 染毒后动物毒性反应观察指标及相应分级

表2 雄性增重、肝、脾、肾、脑等变量比较 (±s,g)

表2 雄性增重、肝、脾、肾、脑等变量比较 (±s,g)

组别 增重 肝 脾 肾 脑A 87.564± 1.3967 4.0872± 5.805 0.4068± 1.588 0.7440± 1.637 0.2864± 3.553 B 87.196± 1.5654 4.0176± 8.883 0.4232± 1.606 0.76± 1.894 0.2912± 4.216 C 85.98± 1.5009 4.11± 5.848 0.4344± 1.527 0.7464± 1.888 0.2896± 3.628

表3 雌性增重、肝、脾、肾、脑等变量比较 (±s,g)

表3 雌性增重、肝、脾、肾、脑等变量比较 (±s,g)

组别 增重 肝 脾 肾 脑A 84.1± 1.3956 4.08± 5.902 0.42± 1.237 0.73± 2.063 0.29± 1.1485 B 81.5± 1.3729 4.06± 5.921 0.41± 1.617 0.76± 1.568 0.29± 4.000 C 82.4± 1.56 4.06± 5.932 0.42± 1.723 0.75± 2.230 0.29± 4.096

表4 雌雄各组增重、肝、脾、肾、脑等变量比较(±s,g)

表4 雌雄各组增重、肝、脾、肾、脑等变量比较(±s,g)

组别 增重 肝 脾 肾 脑A 85.55± 1.0213 4.08± 4.097 0.41± 1.006 0.74± 1.304 0.29± 2.5743 B 85.6± 1.0780 4.06± 5.302 0.42± 1.129 0.755± 1.218 0.29± 2.885 C 84.4± 1.0960 4.07± 4.127 0.425± 1.150 0.75± 1.446 0.29± 2.710

3 血液学指标比较 见 5～7。实验结束时每只大鼠取右心室血液约 2.5ml,检查红细胞计数、白细胞记数、血红蛋白、血细胞比容、总蛋白量、ALT、AST、尿素氮等指标。结果显示雄性大鼠对照组与涂层组、对照组与基材组之间在 BUN指标上有显著性差异(P＜0.05),对照组高于基材组与涂层组,而基材组与涂层组之间无显著性差异(P＞0.05);其余指标三组两两之间无显著性差异(P＞0.05)。

表5 雄性各组间血液学指标检查结果(±s)

表5 雄性各组间血液学指标检查结果(±s)

组 别 WBC(× 109/L) RBC(× 1012/L) HGB(g/L) HCT A 7.084± 0.4154 8.5484± 0.1261 148.52± 1.1946 0.485± 6.033 B 6.96± 0.4907 8.97± 0.1962 151.64± 2.0896 0.5075± 9.182 C 6.396± 0.356 8.688± 0.1717 148.32± 1.4256 0.4888± 6.932

(续)

表6 雌性各组间血液学指标检查结果(±s)

表6 雌性各组间血液学指标检查结果(±s)

组 别 WBC(× 109/L) RBC(× 1012/L) HGB(g/L) HCT A 6.748± 0.6334 7.6492± 0.142 4136.76± 1.8835 0.45652± 6.600 B 8.02± 0.3638 7.8612± 2.382 141.4± 0.8981 0.46252± 1.6724 C 6.716± 0.4426 7.9108± 0.1626 143.36± 2.3151 0.46752± 7.7119

(续)

4 组织学观察 各组动物总体健康情况良好,肉眼检查见心、肝、脾、肺、肾、胰腺、脑、子宫、睾丸、卵巢、附睾及双侧股部肌肉等各主要脏器及植入物周围无异常病变或肿瘤生长,分别切取各脏器组织块用 10%福尔马林进行固定,然后以石蜡包埋、切片、HE染色,在光学显微镜下进行观察比较,结果显示正常。

表7 雌雄各组间血液学指标检查结果(±s)

表7 雌雄各组间血液学指标检查结果(±s)

组 别 WBC(× 109/L) RBC(× 1012/L) HGB(g/L) HCT A 6.916± 0.37562 8.0988± 0.11395 142.84± 1.40244 0.47078± 4.8718 B 7.49± 0.31165 8.4156± 0.12584 146.52± 1.34232 0.48502± 5.6269 C 6.556± 0.28204 8.2994± 0.12953 145.84± 1.39133 0.47818± 5.3528

(续)

讨 论

随外科技术发展需要,近 20年来金属内固定生物材料发展极为迅速。与美国、日本及许多欧洲发达国家相比,我国在该领域的发展相对较晚。本组所检验的新型钛合金 TLM为介稳定β型钛合金,是由我国自行研制的第 3代体内植入用钛合金。新材料选择了钛、锆、钼、锡、钽及铌等 6种无毒元素制作,相关测试证实具有较好的力学性能[2],采用微弧氧化工艺制作的复相二氧化钛生物活性涂层明显改善生物活性[3],适用于骨外科、口腔外科等领域用于制作钢板、螺钉等内固定器材及关节假体、牙种植体等的理想材料。

理论上来讲,任何材料对生物体都是一个异物,生物体必然要对其产生相应的反应,所以在应用到临床之前要进行严格的安全性评价,其中就包括进行慢性毒性实验[4],以判定材料是否对机体组织健康产生威胁。本组以 SD大鼠作为实验动物,并根据染毒方式与样品用途相适应的原则,选用将材料制备成特定形状后植入动物体内的方法作为染毒方式,使材料有机会接触到体液并产生相互作用,并观察多个指标已增加评价的意义。

在材料植入动物肌肉中后的早期,3组分别有数只动物出现不同程度倦怠、毛发凌乱、活动不积极等表现,3d后症状自行消失,考虑表现异常在实验组间分布无特异性,所以无特殊毒理学意义。在各项血液学指标中,雄性大鼠 Ti-6Al-4V组 BUN数值大于基材和涂层两组。考虑原因:①真实的毒性意义,对照合金毒性反应损害雄性大鼠肾脏功能所致;②干扰因素所致,如检测仪器有误差等。以上差异需要在进一步的动物实验中进行证实。其余在一般毒性表现、大体解剖、血液学指标及重要脏器组织学检查中,新型钛合金及涂层材料两组均显示正常,提示新材料具有体内植入的安全性。

总之,将新型 T LM合金及具有二氧化钛复相涂层的 TLM合金植入 SD大鼠股部肌肉后,在观察时期内,综合考察动物的一般毒性表现、大体观察、血液学指标及主要脏器组织学切片等项目,未发现新材料有慢性毒性反应的证据,初步提示新材料具有体内植入的安全性,为其进一步评价研究及临床应用提供了动物实验证据。

[1] Takamura K.Evaluation of carcinogenicity and chronic toxicity associated with orthopedic implants in mice[J].Biomed Mater Res,1994,28(5):583-589.

[2] 于振涛,周 廉,王克光.生物医用型钛合金设计与开发[J].稀有金属快报,2004,(1):5.

[3] Sun JY, JangBC,Zhu XL,etal. Effectof hydrothermally treated anodic oxide films on osteoblast attachment and prolifcratiom[J].Bio-Materials,2003,24(3):347-355.

[4] 郝和平,奚廷斐 .医疗器械监督管理和评价[M].北京:中国医药科技出版社,2000:129-130.