白毛藤诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡作用及其机制研究

(牡丹江医学院,黑龙江牡丹江157011)

白毛藤(Solamum lyratum Thunb),又名白英、毛凤藤等,系茄科植物白英的全草,全草及根入药,具有祛风湿、解毒消肿、抗癌的作用[1]。国内外研究表明,其对多种体外肿瘤细胞具有抑制作用[3-4],但对其有效成分及其抗肿瘤机制,尤其是分子水平机制研究尚未见进一步报道。本研究拟观察白毛藤水提液对BGC-823细胞是否具有增殖抑制活性及诱导凋亡作用,并初步探讨其分子水平机制,为白毛藤抗癌新药的开发,奠定一定的理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞BGC-823细胞株(武汉中美科技有限公司),RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司),Trizol(Sigma公司),引物核苷酸片段(上海生工生物技术有限公司)。

1.2 实验分组 按白毛藤水提液的浓度分为4组:对照组:含BGC-823细胞的 RPMI-1640培养液;实验组:RPMI-1640培养液倍比稀释的4,8,16mg/mL的白毛藤水提液。

1.3 MTT比色法测定细胞增殖抑制率 每个药物浓度设12个平行孔,每孔细胞密度为1×105个/mL,分别培养12、24和48 h后,加入MTT培养4 h后,弃去培养基,每孔加入 150 μ L二甲基亚砜,酶标仪测定490 nm各孔的(OD)值。比色时以培养液调零。按公式计算细胞生长抑制率(inhibition rate,IR)。IR=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

1.4 细胞凋亡检测 取癌细胞,加0.25%胰酶消化细胞。制备3×105个/mL细胞悬液,每孔接种1 mL。将盖玻片置于37℃、5%CO2培养箱培养24 h,加入不同浓度的白毛藤水提液;对照组加同体积培养液,培养48 h。胰酶消化,冷PBS 3遍冲洗,固定液10 min固定,弃去,双蒸水 3遍冲洗,干燥,Hoechst3325837℃、5%CO2培养箱中孵育15 min,将孔中的盖玻片取出,荧光显微镜观察细胞形态。

1.5 RT-PCR反应 提取肿瘤细胞总RNA,以提取的总RNA为模板,设计引物如下:Bcl-2基因引物,上游 :5′-GACTTCTCGTCGCTACCGTC-3′;下游 :5′-TGCACCTACCCAGCCTCCCTTATC-3′;296bp。Fas基因引物,上 游:5′-CGCCTATGGTTGTTGACC-3′;下 游 :5′-CCTTCTGTTACAGACCTC-3′;产物长度 477bp。β-action基因引物,上游 :5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′,下游 :5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′;产 物 长 度838bp。PCR反应30个循环,95℃预变性5 min,94℃50s,55℃退火1 min,72℃延伸1min,72℃复性7 min。β-action作为阳性对照,待测基因mRNA表达相对值=待测基因mRNA光密度/β-action mRNA光密度。

1.6 统计学分析 采用SPSS 11.5统计分析软件处理。数据以均数±标准差(¯±s)表示,进行t检验。

2 结果

2.1 MTT比色法测定BGC-823细胞增殖能力 白毛藤水提液作用时间延长,对BGC-823细胞增殖抑制的作用增强,48 h各组细胞增殖作用最强(P＜0.01);白毛藤水提液浓度增加,对细胞增殖抑制作用增强,16 mg/mL时作用最明显(P＜0.05)。白毛藤水提液抑制胃癌细胞的增殖,具有明显的浓度和时间依赖性(表1)。

表1 各组胃癌BGC-823细胞增殖情况(±s)mg/mL

表1 各组胃癌BGC-823细胞增殖情况(±s)mg/mL

注:与4 mg/mL白毛藤实验组比较,##P＜0.01。

组 别 剂量/(mg/mL)生长抑制率/%12 h 24 h 48 h对照组 — — — —实验组 4 6.16±0.11 9.03±0.85 19.30±1.52实验组 8 24.44±0.23##28.32±0.98##48.20±1.05##实验组 16 42.51±0.44##71.35±5.23##86.89±1.02##

2.2 细胞凋亡情况检测 荧光显微镜观察不同浓度白毛藤水提液作用48 h后,细胞凋亡情况,不同剂量实验组见凋亡细胞增多,凋亡细胞呈碎块状致密浓染,或细胞核致密浓染(图略)。

2.3 各组BGC-823 Fas和Bcl-2基因表达水平 与对照组比较,不同浓度白毛藤作用48 h后,肿瘤细胞中Bcl-2基因mRNA表达降低,Fas基因mRNA表达增加,以16 mg/mL组最明显(表2)。

表2 各组Bcl-2和Fas表达情况(±s) mg/mL

表2 各组Bcl-2和Fas表达情况(±s) mg/mL

注:与对照组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

组 别 剂量/(mg/mL) Bcl-2/β-Actin Fas/β-Actin对照组 — 0.85±0.02 0.27±0.01实验组 4 0.66±0.04 0.39±0.02实验组 8 0.34±0.02## 0.63±0.05##实验组 16 0.26±0.01## 0.74±0.06##

3 讨论

胃癌是常见的消化道肿瘤之一,化学治疗是最常用的治疗方式,但存在严重的机体的损伤和耐药性。而抗肿瘤中药不易产生耐药性,机体的损伤较小,因此,从传统中药中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物具有非常重要的意义。

细胞凋亡为生理性细胞死亡方式,是在机体的精密调节下的细胞按部就班地死亡过程,又称程序性细胞死亡(Programed cell death,PCD)。其异常与多种疾病密切相关,如肿瘤、免疫疾病等。相关基因分为3类型:(1)细胞凋亡过程中表达基因;(2)促进细胞凋亡的基因;(3)抑制细胞凋亡的基因。促进细胞凋亡的基因,Fas属TNFR/NGFR家族,定位于人染色体10q24.1,其产物是分子量45kd的跨膜蛋白,它与其天然配体膜蛋白Fas-L(分布于T效应细胞)结合,从而细胞内传递“分子信号”,诱导细胞走向凋亡[5-6]。白毛藤水提液可以明显上调胃癌细胞Fas基因表达,随着药物浓度的增加,肿瘤细胞中Fas基因表达逐步上调,与对照组比较,差异具有统计学意义。说明Fas与胃癌生长密切相关,白毛藤水提液可能通过上调Fas,促进胃癌细胞的凋亡,抑制胃癌细胞的生长。抑制细胞凋亡的基因,Bcl-2定位于人染色体18q21.3,现有研究发现[7-10],Bc1-2在多种肿瘤的细胞凋亡调控中发挥重要作用,Bc1-2与调节蛋白Bax形成二聚体,Bc1-2/Bax比率高时,Bcl-2抑制细胞凋亡[11]。本研究结果证实,白毛藤水提液可以明显下调胃癌细胞Bcl-2基因表达,随着白毛藤水提液药物浓度的增加,肿瘤细胞中Bcl-2基因表达逐步下调,与对照组比较,差异具有统计学意义。白毛藤水提液可通过下调Bcl-2,抑制细胞凋亡,从而影响肿瘤细胞的生长。

综上所述,白毛藤水提液可能通过调控Bcl-2及Fas基因的表达,从而诱导胃癌细胞的凋亡。然而,其具体有效成分及其抗癌机制有待进一步的实验研究。

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