日本血吸虫TβRII样基因胞外段的克隆、表达及初步鉴定*

陈 姗,马长玲,高志岩,麦璟莹,赵晶晶,朱郇悯,李小敏,李 孜

转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族成员在细胞的生长、分化、细胞外基质的形成和免疫调节等方面都发挥着重要作用〔1-8〕。TβR(TGF-β受 体)有多 种,其 中 I 型(TβRI)、II型(TβRII)、III型(TβRIII)分布于多类细胞膜上。TβRI和 TβRII在 TGF-β信号转导中起主导作用,TβRII具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在生理浓度下可单独与 TGF-β结合,结合后TβRII胞内段结构发生改变,再与 TβRI结合形成 TGF-β-TβRII-TβRI复合体,随之 TβRI胞内段发生磷酸化,引起下游smad蛋白家族的一系列变化,从而将信号传递于细胞胞核内〔9-10〕,调控目的基因表达。

Osman等在曼氏血吸虫发现了 TβRII(SmTβRII),该基因大约为26kb,由9个外显子组成。序列比对表明,SmTβRII与哺乳动物(大鼠,小鼠,人)活性TβRII有一定的同源性。应用siRNA技术,沉默SmTβRII,可引起抱雌沟蛋白(Gynecophoral canal protein,GCP)表达减少,表明SmTβRII通过激活 TGF-β信号通路诱导GCP表达,提示TGF-β信号通路在雄虫促雌虫发育成熟方面起着重要作用〔11〕。在此基础上我们推测日本血吸虫亦有可能存在 TβRII(SjTβRII),在虫体自身发育和对宿主致病过程中发挥重要作用。本文通过RACE方法,获得日本血吸虫 TβRII样基因全长cDNA序列,在生物信息学分析的基础上,克隆、原核表达其N端(即胞外段),为进一步研究其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 E.coil BL21(DE3)菌种、原核表达载体pET28a(+)质粒均由本教研室保存,pMD19-T Vector购自TaKaRa公司。

1.1.2 实验动物和钉螺 新西兰大白兔购自广东省实验动物中心,阳性钉螺(Oncomelaniahupensis)购自江西省血吸虫病防治研究所。

1.1.3 主要试剂 T RIzol试剂购自Invitrogen公司,Taq DNA聚合酶、RT-PCR试剂盒、Marker DL2000、限制性内切酶、T4连接酶、蛋白质低分子量标准均购自TaKaRa公司;质粒小量抽提试剂盒及DNA胶回收纯化试剂盒购自美国Axygen公司,His·Tag融合蛋白纯化试剂盒购自QIAGEN公司,HRP标记的山羊抗大鼠二抗购自北京中杉金桥公司。……